Традиційна селекція мікроорганізмів (в основному бактерій та грибів) заснована на експериментальному мутагенезі та відборі найбільш продуктивних штамів. Але тут є свої особливості. Геном гаплоїдний бактерій, будь-які мутації виявляються вже в першому поколінні. Хоча ймовірність природного виникнення мутації у мікроорганізмів така ж, як і у всіх інших організмів (1 мутація на 1 млн. особин за кожним геном), дуже висока інтенсивність розмноження дає можливість знайти корисну мутацію за цікавим для дослідника геном.
В результаті штучного мутагенезу та відбору було підвищено продуктивність штамів гриба пеніцилу більш ніж у 1000 разів. Продукти мікробіологічної промисловості використовуються у хлібопеченні, пивоварінні, виноробстві, приготуванні багатьох молочних продуктів. За допомогою мікробіологічної промисловості отримують антибіотики, амінокислоти, білки, гормони, різні ферменти, вітаміни та багато іншого.
Мікроорганізми використовують для біологічного очищення стічних вод, покращень якостей ґрунту. В даний час розроблені методи отримання марганцю, міді, хрому при розробці відвалів старих копалень за допомогою бактерій, де звичайні методи видобутку економічно невигідні.
Біотехнологія- Використання живих організмів та їх біологічних процесів у виробництві необхідних людині речовин. Об'єктами біотехнології є бактерії, гриби, клітини рослинних та тваринних тканин. Їх вирощують на живильних середовищах у спеціальних біореакторах.
Найновішими методами селекціїмікроорганізмів, рослин та тварин є клітинна, хромосомна та генна інженерія.
Генна інженерія
Генна інженерія- Сукупність методик, що дозволяють виділяти необхідний ген з геному одного організму і вводити його в геном іншого організму. Рослини та тварини, в геном яких впроваджено «чужі» гени, називаються трансгенними, бактерії та гриби трансформованими. Традиційним об'єктом генної інженерії є кишкова паличка, бактерія, що у кишечнику людини. Саме з її допомогою отримують гормон росту - соматотропін, гормон інсулін, який раніше отримували з підшлункових залоз корів і свиней, інтерферон білок, що допомагає впоратися з вірусною інфекцією.
Процес створення трансформованих бактерій включає наступні етапи.
- Рестрикція- Вирізання потрібних генів. Проводиться за допомогою спеціальних «генетичних ножиць», ферментів. рестриктаз.
- Створення вектору- спеціальної генетичної конструкції, у складі якої намічений ген буде впроваджений геном іншої клітини. Основою створення вектора є плазмиды. Ген вшивають у плазміду за допомогою іншої групи ферментів – лігаз. Вектор повинен містити все необхідне для керування роботою цього гена - промотор, термінатор, ген-оператор і ген-регулятор, а також маркерні гени, які надають клітині-реципієнту нових властивостей, що дозволяють відрізнити цю клітину від вихідних клітин.
- Трансформація- Впровадження вектора в бактерію.
- Скринінг- Відбір тих бактерій, в яких впроваджені гени успішно працюють.
- Клонуваннятрансформованих бактерій
1 - клітина з вихідною плазмідою; 2 - виділена плазміда; 3 - створення вектора; 4 - рекомбінантна плазміда (вектор); 5 – клітина з рекомбінантною плазмідою.
Еукаріотичні гени, на відміну прокаріотичних, мають мозаїчну будову (екзони, інтрони). У бактеріальних клітинах відсутня процесинг, а трансляція у часі та просторі не відокремлена від транскрипції. У зв'язку з цим для пересадки ефективніше використати штучно синтезовані гени. Матрицею для такого синтезу є іРНК. За допомогою ферменту зворотна транскриптаза на цій іРНК спочатку синтезується ланцюг ДНК. Потім на ній за допомогою ДНК-полімерази добудовується другий ланцюг.
Хромосомна інженерія
Хромосомна інженерія- Сукупність методик, що дозволяють здійснювати маніпуляції з хромосомами. Одна група методів заснована на введенні в генотип рослинного організму пари чужих гомологічних хромосом, що контролюють розвиток необхідних ознак. доповнені лінії), або заміщення однієї пари гомологічних хромосом на іншу ( заміщені лінії). В отриманих таким чином заміщених та доповнених лініях збираються ознаки, що наближають рослини до «ідеального сорту».
Метод гаплоїдівзаснований на вирощуванні гаплоїдних рослин із наступним подвоєнням хромосом. Наприклад, з пилкових зерен кукурудзи вирощують гаплоїдні рослини, що містять 10 хромосом ( n= 10), потім хромосоми подвоюють і отримують диплоїдні ( n= 20), повністю гомозиготні рослини лише за 2-3 роки замість 6-8-річного інбридингу.
Сюди ж можна зарахувати і метод отримання поліплоїдних рослин(Див. Лекція 23 «Селекція рослин»).
Клітинна інженерія
Клітинна інженерія- Конструювання клітин нового типу на основі їх культивування, гібридизації та реконструкції.
Клітини рослин і тварин, поміщені в живильні середовища, що містять усі необхідні для життєдіяльності речовини, здатні ділитися, утворюючи клітинні культури. Клітини рослин мають ще й властивість тотипотентності, тобто при певних умоввони здатні сформувати повноцінну рослину. Отже, можна розмножувати рослини в пробірках, поміщаючи клітини у певні живильні середовища. Це особливо актуально щодо рідкісних чи цінних рослин.
За допомогою клітинних культур можна отримувати цінні біологічно активні речовини (культура клітин женьшеню). Отримання та вивчення гібридних клітин дозволяє вирішити багато питань теоретичної біології (механізми клітинної диференціювання, клітинного розмноження та ін.). Клітини, отримані внаслідок злиття протопластів соматичних клітин, що належать до різних видів (картоплі та томату, яблуні та вишні та ін.), є основою для створення нових форм рослин. У біотехнології для отримання моноклональних антитіл використовуються гібридоми- Гібрид лімфоцитів з раковими клітинами. Гібридоми наробляють антитіла, як лімфоцити, і мають можливість необмеженого розмноження в культурі, як ракові клітини.
Метод пересадки ядер соматичних клітин у яйцеклітини дозволяє отримати генетичну копію тварини, тобто робить можливим клонуваннятварин. В даний час отримані клоновані жаби, отримані перші результати клонування ссавців.
Метод злиття ембріонів на ранніх стадіях уможливлює створення химернихтварин. Таким способом були отримані химерні миші (злиття ембріонів білих та чорних мишей), химерна тварина вівця-коза.
Цей довідник містить весь теоретичний матеріал з курсу біології, необхідний для здавання ЄДІ. Він включає всі елементи змісту, що перевіряються контрольно-вимірювальними матеріалами, і допомагає узагальнити і систематизувати знання і вміння за курс середньої (повної) школи.
Теоретичний матеріал викладено у короткій, доступній формі. Кожен розділ супроводжується прикладами тестових завдань, що дозволяють перевірити свої знання та ступінь підготовленості до атестаційного іспиту. Практичні завдання відповідають формату ЄДІ. Наприкінці посібника наводяться відповіді до тестів, які допоможуть школярам та абітурієнтам перевірити себе та заповнити наявні прогалини.
Посібник адресований школярам, абітурієнтам та вчителям.
Клітинна інженерія – це напрямок у науці та селекційній практиці, який вивчає методи гібридизації соматичних клітин, що належать різним видам, можливості клонування тканин або цілих організмів з окремих клітин.
Одним з найпоширеніших методів селекції рослин є метод гаплоїдів – отримання повноцінних гаплоїдних рослин із сперміїв або яйцеклітин.
Отримані гібридні клітини, що поєднують властивості лімфоцитів крові і пухлинних клітин, що активно розмножуються. Це дозволяє швидко та в потрібних кількостях отримувати антитіла.
Культура тканин - Застосовується для отримання в лабораторних умовах рослинних або тваринних тканин, а іноді і цілих організмів. У рослинництві використовується для прискореного одержання чистих диплоїдних ліній після обробки вихідних форм колхіцином.
Генна інженерія- Штучне, цілеспрямоване зміна генотипу мікроорганізмів з метою отримання культур із заздалегідь заданими властивостями.
Основний метод- Виділення необхідних генів, їх клонування та введення в нове генетичне середовище. Метод включає такі етапи роботи:
- виділення гена його поєднання з молекулою ДНК клітини, яка зможе відтворювати донорський ген в іншій клітині (включення до плазміди);
- Введення плазміди в геном бактеріальної клітини - реципієнта;
- Відбір необхідних бактеріальних клітин для практичного використання;
– дослідження у галузі генної інженерії поширюються як на мікроорганізми, а й у людини. Вони особливо актуальні при лікуванні хвороб, пов'язаних із порушеннями в імунній системі, у системі згортання крові, в онкології.
Клонування . З біологічної точки зору клонування – це вегетативне розмноження рослин та тварин, потомство яких несе спадкову інформацію, ідентичну батьківській. У природі клонуються рослини, гриби, найпростіші тварини, тобто. організми, що розмножуються вегетативним шляхом. В останні десятиліття цей термін стали вживати під час пересадки ядер одного організму в яйцеклітину іншого. Прикладом такого клонування стала відома овечка Доллі, отримана в Англії 1997 року.
Біотехнологія– процес використання живих організмів та біологічних процесів у виробництві ліків, добрив, засобів біологічного захисту рослин; для біологічного очищення стічних вод, для біологічного видобутку цінних металів із морської води тощо.
Включення геном кишкової палички гена, відповідального за освіту в людини інсуліну дозволило налагодити промислове отримання цього гормону.
У сільському господарстві вдалося генетично змінити десятки продовольчих та кормових культур. У тваринництві використання гормону росту, отриманого біотехнологічним шляхом, дозволило підвищити надої молока;
за допомогою генетично зміненого вірусу створити вакцину проти герпесу у свиней. За допомогою новостворених генів, введених у бактерії, отримують ряд найважливіших біологічно активних речовин, зокрема гормони та інтерферон. Їхнє виробництво склало важливу галузь біотехнології.
З розвитком генної і клітинної інженерії у суспільстві виникає дедалі більше занепокоєння щодо можливих маніпуляцій з генетичним матеріалом. Деякі побоювання теоретично виправдані. Наприклад, не можна виключити пересадок генів, що підвищують стійкість до антибіотиків деяких бактерій, створення нових форм харчових продуктів, проте ці роботи контролюються державами та суспільством. У будь-якому разі небезпека від хвороб, недоїдання та інших потрясінь значно вища, ніж від генетичних досліджень.
Перспективи генної інженерії та біотехнології:
- Створення організмів, корисних для людини;
- Отримання нових лікарських препаратів;
- Корекція та виправлення генетичних патологій.
ПРИКЛАДИ ЗАВДАНЬ
Частина А
А1. Виробництвом ліків, гормонів та інших біологічних речовин займається такий напрямок, як
1) генна інженерія
2) біотехнологічне виробництво
3) сільськогосподарська промисловість
4) агрономія
А2. У якому випадку метод культури тканин виявиться найкориснішим?
1) при отриманні гібриду яблуні та груші
2) при виведенні чистих ліній гладкого насіння гороху
3) за необхідності пересадити шкіру людині при опіку
4) при отриманні поліплоїдних форм капусти та редьки
А3. Для того щоб штучно отримувати людський інсулін методами генної інженерії у промислових масштабах, необхідно
1) ввести ген, який відповідає за синтез інсуліну в бактерії, які почнуть синтезувати людський інсулін
2) запровадити бактеріальний інсулін в організм людини
3) штучно синтезувати інсулін у біохімічній лабораторії
4) вирощувати культуру клітин підшлункової залози людини, яка відповідає за синтез інсуліну.
ЧастинаЗ
З 1. Чому в суспільстві багато хто боїться трансгенних продуктів?
- 3.2. Відтворення організмів, його значення. Способи розмноження, подібність та відмінність статевого та безстатевого розмноження. Використання статевого та безстатевого розмноження у практичній діяльності людини. Роль мейозу та запліднення у забезпеченні сталості числа хромосом у поколіннях. Застосування штучного запліднення у рослин та тварин
» Зміст книги
Лекція №5
Тема: Біотехнологія та генетична інженерія.
Запитання: 1. Поняття про біотехнологію
2. Генна інженерія та її методи.
1. Поняття про біотехнологію
Сучасна біотехнологія займає провідне положення в системі біологічних, медичних, ветеринарних та зоотехнічних досліджень, що є нову формупромислової технології, основу якої складають біологічні об'єкти - тварини, рослини та мікроорганізми.
Основна мета та завдання біотехнології спрямовані на розробку методів та прийомів, що дозволяють отримувати біологічно активні сполуки (ферменти, гормони, вакцини), а також конструювати молекули нових речовин та створювати нові форми організмів, які відсутні у природі (химерні молекули, тварини).
У тваринництві широко використовують різні біотехнологічні методи (генна та клітинна інженерія), за допомогою яких можна прискорити селекційний процес створення нових високопродуктивних порід с.-г. тварин.
У біотехнології користуються двома термінами, що відрізняються змістовим змістом: «Генна інженерія» - як прийом вивчення та впливу на процеси, що проходять на рівні молекул і генів, і термін «Генетична інженерія» - як комплекс методів, що проводяться у більш широкому плані на клітинах та організмі в цілому.
У принципі обидва терміни є синонімами і мають на увазі методи, що забезпечують переробку та реконструкцію генетичного матеріалу, тобто. формування нової спадковості.
Використання досягнень генної інженерії йде переважно у таких напрямах:
вивчення організації генетичного апарату вищих організмів;
використання мікроорганізмів як продуцентів господарсько корисних речовин;
конструювання нових організмів шляхом пересадки чужорідних генів, тобто. одержання трансгенних тварин.
підвищення ефективності та прискорення селекційного процесу;
підвищення коефіцієнта розмножуваності самок;
збереження цінних, мінімальних популяцій генофонду зникаючих порід;
отримання нащадків від безплідних, але генетично цінних тварин;
підвищення стійкості тварин до захворювань;
отримання монозиготних близнюків однієї певної статі;
отримання химер, що розвиваються з ембріонів 5-6 денного віку різних тварин (порід, видів) та об'єднаних в одне ціле;
підвищення плодючості корів шляхом пересадки половин ембріона в обидва роги матки.
Історично біотехнологія виникла на основі традиційних мікробіологічних (переважно бродильних) виробництв. Багато подібних «технологій» неусвідомлено застосовувалися ще в давнину при отриманні вина, пива, хліба, кисломолочних та квашених продуктів.
З допомогою біотехнології нині отримують десятки дорогих біологічно активних речовин, у тому числі гормони, ферменти, вітаміни, антибіотики, деякі ліки, такі як інсулін, інтерферон та інші.
Для довідки: інсулін – білок, що регулює вміст цукру в крові; інтерферон – білок, що захищає ще неуражені клітини від вірусів (грипу).
Проте, до появи методів генної інженерії інтерферон міг бути отриманий лише у нікчемних кількостях із лейкоцитів (білих кров'яних клітин).
Для отримання 1 г інтерферону потрібно переробити кров від 90 тис. донорів.
Біотехнологічні розробки інтенсивно використовуються при створенні безвідходних процесів виробництва при переробці сировини, очищенні води від нафти, каналізаційних стоків у боротьбі зі шкідниками с.-г. культур, отримання кормового та харчового білка, біогазу та ін.
Так, за допомогою мікробів із 1 тонни нафти виходить близько 1 тонни дріжджів, що містять 600 кг білка.
І ще: при розмноженні 1 бактерія (за оптимальних умов кормових, середовища та ін. факторів) через 44 години зуміла б утворити таке потомство, маса якого відповідала масі нашої планети (близько 6 000 000 000 000 000 000 000 тонн).
Біотехнологічними прийомами, ще 6000 років тому користувалися народи Дворіччя виготовляючи п'янкий напій, тобто. пиво тих часів.
Вміли варити пиво та стародавні єгиптяни використовуючи дріжджі, цукор та бродіння. Римляни та греки використовуючи виноградний сік отримували вино.
На підставі вище сказаного на питання, що таке біотехнологія, ми можемо відповісти так, що це наука про використання живих організмів та біологічних процесів у виробництві.
У зв'язку з вищевикладеним, історію виникнення та розвитку біотехнології можна поділити на три етапи.
Перший етап – зародження біотехнології. Багато сотень років людина, не маючи наукових уявлень про мікробіологію, біохімію та інші науки, розробив і практично успішно використовував методи біотехнології в хлібопеченні, сироробстві, виноробстві, виготовленні кисломолочних продуктів, тобто. найдавніших галузях господарської діяльності.
Другий етап (XIX ст.) - Становлення біотехнології як науки. Початок бурхливого розвитку біотехнологічних наук: генетики, мікробіології, біохімії, вірусології, фізіології, ембріології та ін.
Третій етап (середина 70-х років XX ст.) - Розвиток біотехнології в різних напрямках за допомогою методів генної та клітинної інженерії.
Першими біотехнологічними прийомами у тваринництві стали штучне запліднення тварин та силосування кормів.
Вперше у Росії 1887 р. хірургічним шляхом В.І. Шведов трансплантував подрібнені запліднені яйцеклітини - зиготи щура.
Історія трансплантації ембріонів великої рогатої худоби починається з 1950 р., коли О. Уіллем (США) пересадив запліднену яйцеклітину від однієї телиці іншої та отримав живе теля.
З європейських держав, які стали використовувати трансплантацію ембріонів як метод, що прискорює селекційний процес та підвищує його ефективність, необхідно відзначити Францію, Велику Британію, Данію, Німеччину, Італію, Бельгію, Словаччину.
Сучасний етап розвитку біотехнології пов'язаний із відкриттям нових закономірностей у процесах життєдіяльності організмів на молекулярному рівні.
Розвиток біотехнології призвело до створення промислового виробництваз отримання різних біопрепаратів для використання в медицині, ветеринарії, харчової промисловості.
З кожним роком збільшується кількість технологій, методів та препаратів, призначених підвищити продуктивність тварин та якість продукції. У світі налічують понад 450 біотехнологічних компаній, які виробляють препарати для підтримки здоров'я тварин та підвищення їхньої продуктивності.
Напрямки біотехнології
Один із найперспективніших напрямів – клонування ембріонів, тобто. отримання максимальної кількості нащадків від високопродуктивних тварин
Для цього розроблена методика створення ідентичних (клонів) ембріонів шляхом внесення ядра клітини ембріона висококласної тварини в незапліднену яйцеклітину з попередньо віддаленим ядром, малоцінним у племінному відношенні; поділ ембріонів на два, чотири, шість та вісім частин.
Одноклітинні «синтетичні» ембріони навчилися вирощувати до 8, 16 і навіть 32 клітинної стадії в лабораторних умовах. Тому їх можна як імплантувати коровам чи заморожувати з метою зберігання, а й використовуватиме наступного клонування. Таким чином, можна in vitro отримувати необмежену кількість ембріонів, крім процедури їх взяття у високопродуктивних тварин. Теоретично від одного ембріона великої рогатої худоби можна мати тисячі тварин.
Інше досягнення біотехнологічних досліджень у галузі тваринництва, що має практичне значення, - метод отримання трансгеннихтварин, геном яких «вбудований» чужорідний ген. З його допомогою за короткий період можна отримати тварин, що швидко ростуть, з високою молочною продуктивністю, стійкістю до хвороб і т.д.
Здобуття навіть однієї тварини з успадкованим пересадженим геном вважається великим досягненням. Таку тварину розглядають як основу для створення нової лінії.
Сьогодні біотехнологія використовується при вирішенні багатьох практичних питань щодо підвищення ефективності охорони здоров'я, збільшення продовольчих ресурсів країни та забезпечення різних виробництв сировиною, створення та використання рентабельних відновлюваних джерел енергії та безвідходних виробництв, скорочення шкідливих антропологічних впливів на навколишнє природне середовище та в інших галузях.
В даний час, у найбільш розвинених країнах створені та продовжують створюватися підприємства, які використовуючи біотехнологію виробляють корми та кормові добавки, продукти харчування, медичні препарати, проводять трансплантацію ембріонів та вирішують інші господарські завдання.
Вважають, що подальший прогрес людства не тільки багато в чому залежатиме від розвитку біотехнології, але й просто не зможе без неї обійтися, тому що немає поки що інших науково обґрунтованих пропозицій забезпечити насамперед продуктами харчування все зростаюче населення Землі.
Найбільш перспективними напрямками в біотехнології є виробництва, пов'язані з нетрадиційним отриманням на біофабриках, у необхідних кількостях білка, незамінних амінокислот, лікарських препаратів, біогазу та перетворення сонячної енергії.
2. Генна інженерія та її методи
Сучасна генна інженерія користується комплексом різноманітних методів та технологій на рівні молекул, клітинних елементів (хромосом, ядра), соматичних та статевих клітин, на організмі, що знаходиться на різних стадіях онтогенезу.
Процес синтезу інтерферону хімічним способом із крові тварин складний і тривалий. Тому використовували мікроорганізми, отримані методом генної інженерії, здатні продукувати інтерферони людини, які активізують процеси, що впливають на противірусну стійкість.
Методами генної інженерії у промислових умовах було отримано інсулін, гормон зростання людини, інтерферон. Перебувають у створенні методи синтезу альбуміну, різних вакцин, деяких ферментів, гормону зростання с.-г. тварин.
На основі генної інженерії створюється генотерапія, що дає змогу виправляти спадкові дефекти шляхом введення в організм повноцінних генів. Цим шляхом отримано миші-гіганти. У їхній геном «вбудували» ген гормону росту.
3. Клітинна та ембріональна інженерія.
Клітинна інженерія.Під клітинною інженерією розуміють метод конструювання клітин нового типу на основі їхнього культивування, гібридизації та реконструкції.
Одним із важливих напрямів клітинної інженерії є гібридизація соматичних клітин.
Сутність її полягає у поєднанні клітин з хромосомними наборами дуже далеких видів.
При соматичній гібридизації використовують здатність клітин у культурі з'єднуватися в одну та утворювати ядро, що містить хромосоми різних геномів. Здійснюється це за допомогою вірусу Сендай.
В даний час отримані гібридні культури клітин десятків далеких видів (миша х курка; миша х мавпа; кролик х мавпа; соя х горох; соя х кукурудза і т.д.).
Виявилося можливим з'єднання в одній клітині і таких далеких форм, як курка х дріжджі та ін.
Проте, міжвидова несумісність залишається законом і за соматичної гібридизації.
Згодом у гібридній культурі відбувається поділ на клітини того й іншого виду, що не містять хромосоми другого виду.
Ця обставина виявилася надзвичайно цінною для вивчення локалізації та характеру дії тих чи інших генів.
Ембріональна інженерія. До цього напряму належить трансплантація ембріонів. Біотехнологія у відтворенні та селекції великої рогатої худоби має особливе значення. Велика рогата худоба відноситься до одноплідних видів ссавців. У кращому разі, від кожної корови отримують одного теляти на рік, тоді як у яєчнику міститься сотні тисяч незрілих статевих клітин – ооцитів, що становлять величезний генетичний резерв.
Кардинальне вирішення проблеми прискореного відтворення худоби полягає в тому, щоб перейти до нетрадиційних способів збільшення плодючості. У перспективі біотехнологія сприймається як основа прискореного відтворення високопродуктивних тварин та цілих популяцій.
До методів біотехнології, що застосовуються на практиці відтворення, відносять штучне запліднення, глибоке заморожування і тривале зберігання сперми бугаїв, викликання статевого полювання та його синхронізація, регулювання часу отелень.
Останнім часом поряд із цими традиційними біотехнічними методами набула практичного значення трансплантація ембріонів, що розглядається як ефективний метод біотехнології прискореного розмноження високоцінних племінних тварин.
Трансплантація ембріонів великої рогатої худоби – це новий біотехнічний метод прискореного відтворення високопродуктивних тварин, який значно підвищує роль маткового поголів'я, є складову частинупрограми селекції є одним із способів інтенсифікації використання генетичного потенціалу корів-рекордисток. Трансплантація ембріонів ефективна тільки при використанні генетично цінних тварин, перевірених за якістю потомства та визнаних покращувачами.
Якщо врахувати, що від одного донора можна отримувати ембріони 4-5 разів на рік, то вже на сучасному етапірозвитку біотехніки трансплантації очевидна реальна можливістьщорічного здобуття 20-25 телят від однієї корови рекордистки. Використовуючи 20 корів-рекордисток як донори ембріонів, протягом 2-3 років можна створити високопродуктивне молочне стадо 200-300 корів. Традиційним способом від тих же 20 корів за цей період можна отримати не більше 30 телиць та 30 бичків.
Корів, телиць, яким пересаджують ембріони, прийнято називати реципієнтами, а корів, яких отримують ембріони – донорами. Ефект від трансплантації значною мірою визначається вибором корів. Як донорів використовують найкращих, а як реципієнтів – найгірших за селекційними ознаками корів або телиць.
Чим вище відмінності між донором і реципієнтом, тим доцільніше застосування методу трансплантації, що базується на використанні як донорів корів з рекордно високою продуктивністю. Для запліднення корів-донорів використовують насіння найкращих бугаїв, оцінених за якістю потомства.
Найбільш важливе значенняметод трансплантації ембріонів може мати при виведенні та відборі видатних за племінною цінністю виробників, так як збільшується можливість відбору бичків від матерів із рекордно високою продуктивністю.
Отримання бичків-трансплантантів від видатних батьків не знижує проблему їхньої подальшої оцінки якості потомства, але значно підвищує ймовірність відбору (за рахунок підвищення селекційного диференціала матерів) видатних покращувачів для використання в племінних заводах і в умовах великомасштабної селекції.
Застосування методу трансплантації ембріонів ставить усю селекційну роботу на новий інтенсивний шлях розвитку порід, забезпечуючи підвищення продуктивності за рахунок одержання та широкого використання виробників із високою комбінаційною здатністю.
Трансплантація ембріонів розвивається швидкими темпами, а сам метод там використовують у комерційних цілях. У США створено понад 80 комерційних центрів із пересадки ембріонів. У цій країні, де трансплантацію ембріонів поставлено на міцну технологічну основу, отримують щорічно понад 100 тис. телят. Аналогічні комерційні організації з трансплантації ембріонів створені та інших розвинених країн Західної Європи. У СРСР розробки з трансплантації ембріонів розпочато в середині 70-х років.
Мета трансплантації полягає в наступному:
створення порід, ліній, сімейств або спеціалізованих типів тварин;
Консолідація чи вдосконалення існуючих порід, ліній, сімейств тварин;
Схрещування порід, ліній, сімейств та міжвидової гібридизації;
Регулювання багатоплідності сільськогосподарських тварин;
Проведення наукових дослідженьта підготовка спеціалістів (як навчальний процес).
Відбір донорів та проведення поліовуляції.
Найважливішим критерієм перших етапах відбору корів-донорів служить їхня висока племінна цінність, тобто. здатність передавати гени високої продуктивності своїм нащадкам. Племінна цінність донора має підтверджуватись не лише високою продуктивністю самої корови, а й її родичів. До групи донорів, відібраних як матерів майбутніх бугаїв-плідників, включають кращих корів племінних стад.
Спочатку племінну цінність корови-донора визначають за молочною продуктивністю із закінченою лактацією тривалістю 305 днів, вмістом жиру та білка в молоці, придатності корів до машинного доїння, міцності конституції та екстер'єру.
При підборі до донорів пред'являють загальні та спеціальні вимоги. До загальним вимогамвідносяться такі:
Тварина має бути клінічно здоровою;
Донор повинен бути оцінений за типом нервової системи, екстер'єру та конституції;
Донор повинен бути оцінений по відтворювальним якостям (розвитку та фізіологічному стану статевих органів, величині сервіс-періоду, якості та життєздатності приплоду);
На кожного донора має бути оформлене ветеринарне свідоцтво із зазначенням його клінічного стану.
До спеціальних відносять вимоги, що сприяють досягненню кінцевої мети трансплантації ембріонів, при цьому необхідно враховувати таке:
Донор повинен бути типовим представником породи, лінії, сімейства за екстер'єром, конституцією та господарсько корисними ознаками;
Донор може бути оцінений за племінними ознаками з допомогою біометричних методів;
Характерні господарсько корисні ознаки донора мають оцінити можливість їх фенотипічної сумісності в планованих генотипах тварин.
Високі витрати на отримання телят шляхом трансплантації ембріонів зумовлюють необхідність відбирати таких донорів, від яких можна регулярно отримувати велику кількість ембріонів. Перевагу слід віддавати коровам, що зберегли протягом трьох отелів стабільну відтворювальну здатність. Від корів-донорів з хорошими та стійкими відтворювальними здібностями можна регулярно отримувати через кожні 2 місяці ембріони.
Якщо виходити із загальноприйнятого становища, що з корови треба отримувати одного теля в рік, то міжготельний період у середньому повинен перевищувати 365 днів. Отже, отримання від кожної корови по одному теля за 365 днів є основним показником її хорошої відтворювальної здатності.
Для оцінки відтворювальної здатності можна використовувати індекс відтворювальної здатності І НД, який визначається за формулою ІВС = (п-1) 365 100 Д, де п-число отриманих телят, Д – число днів між першим та останнім готелями. При стабільній відтворювальної здатності індекс не повинен перевищувати 100.
Тривалість ембріонального періоду у корів у середньому становить 285 днів, отже оптимальний сервіс-період не повинен перевищувати 80 днів. У цей період корова має бути заплідненою.
Після відбору корів-донорів приступають до множинної овуляції (поліовуляції). Цей метод було розроблено радянським ембріологом М.М. Завадовським та його співробітниками. Ними було доведено, що якщо ввести в кров самки гонадотропні гормони, це призводить до стимулювання дозрівання додаткової кількості фолікулів. Як гонадотропний гормон використовувалася сироватка лошат кобил (СЖК).
Важливою ланкою у сучасній біотехнології трансплантації ембріонів великої рогатої худоби є гормональне викликання суперовуляції у корів-донорів. До групи донорів переводять лише тих корів, які позитивно реагують на введення гормонів.
Для стимуляції множинної овуляції використовують гонадотропін СЖК у поєднанні з простагландинами та іншими біологічно активними речовинами. Цей спосіб дозволяє викликати поліовуляцію приблизно у 70% корів. Оптимальним результатом поліовуляції є вихід з яєчника у вирву яйцеводи 10-20 яйцеклітин. Середня кількість овуляцій становить близько 10, а заплідненість яйцеклітин досягає 80%.
Однак, лише невелика частина донорів виявляє повторну реакцію яєчників після викликання поліовуляції. Здебільшого корови-донори нерегулярно відповідають повторну гормональну обробку, тобто. один раз реагують добре, а вдруге – погано. Тому кількість овуляцій та вихід ембріонів не є стабільними.
На поліовуляцію впливають і такі фактори, як стадія лактації, мертвонароджуваність або важкі отелі, час прояву еструсу, доза СЖК, місяць готелі, порода, господарські умови, жива маса донора, стреси, рівень та якість годівлі тощо.
Виявлено, що подовження періоду лактації сприяє кращій реакції корів на СЖК, що вводиться. Оптимальним терміном для викликання поліовуляції у лактуючих корів чорно-рябої породи є період з 60-го дня після отелення.
Для оптимізації поліовуляції та отримання біологічно повноцінних ембріонів необхідно забезпечити повноцінне годування донора, збалансоване за всіма поживними речовинами.
Оптимальна доза для корів-донорів СЖК – 2500-3000 ІІ. При ін'єкції такої дози одержують у середньому 9 овуляцій на одного позитивно реагуючого донора.
Найвищий ефект поліовуляції досягають при введенні СЖК між 10-12 дібами естрального циклу (середина лютеальної фази) і через другу добу простагландину, що викликає регресію жовтого тіла, статеве полювання і овуляцію. Протягом 48 годин після ін'єкції простагландину у 95% корів-донорів відбувається поліовуляція з усіма ознаками еструсу.
Багаторазова поліовуляція схильна до великої мінливості. Тому не всі корови-донори мають однакову схильність до багаторазової овуляції. Для ефективної багаторазової поліовуляції необхідний ретельний добір донорів за низкою показників.
Вибір виробників.
При відборі бугаїв їх оцінюють за каріотипом з метою виключення хромосомних аномалій. Нащадки відібраних виробників не повинні мати екстер'єрно-конституційних дефектів.
У переважній більшості випадків підбір виробників та донорів проводиться за планом замовного спарювання відповідно до селекційної програми. Сперма виробників, що відбираються для запліднення донорів, повинна характеризуватись найвищою запліднюваністю, не нижче 85-90 %.
Основний критерій відтворювальної здатності виробників – показник запліднюючої здатності їхньої сперми. Так, для оцінки виробника, що перевіряється (бика, кнура, барана) по запліднюючої здатності сперми організують контрольне спарювання. Для цього відбирають із різних стад три-чотири групи корів (800-1000 гол.).
Якщо запліднююча здатність сперми бика, що перевіряється, становить 60 % і менше, то такого бика вибраковують. Насправді цей показник визначається кількістю (відсотком) корів, запліднених від першого запліднення. Запліднення встановлюють по відсутності статевого полювання протягом 60-90 днів після запліднення.
Методи штучного запліднення дозволяють значно раніше визначити запліднюючу здатність сперми. Так, інтенсивність бракування бугаїв за статевою активністю та якістю сперми становить 25-30 %. Значна кількість сперми (20-30 %) бракується в оцінці свіжо- отриманих еякулятів, 10-15 % - при біологічному контролі сперми через 24 години після заморожування.
Осіменіння корів-донорів.
Ефективність поліовуляції надалі визначається ефективністю штучного запліднення донорів. Результати численних досліджень показують, що лише 60-65% одержуваних ембріонів придатні для пересадки реципієнтам. Інші 35-40% складають яйцеклітини або дегенеровані ембріони.
Для штучного запліднення корів-донорів необхідно використовувати сперму лише видатних бугаїв-плідників, достовірно оцінених за якістю потомства.
Вимоги до оцінки запліднюючої здатності сперми бугаїв, призначеної для запліднення корів-донорів, повинні бути значно вищими, ніж при заплідненні інших корів. Запліднююча здатність сперми таких бугаїв повинна становити не нижче 70 % за високої точності її оцінки.
Для підвищення запліднення донорів та виходу ембріонів, поряд з використанням високоякісної сперми, необхідно визначити терміни статевого полювання для своєчасного проведення штучного запліднення. Багато ознак поліовуляції свідчать, що лише короткий період є найбільш сприятливим для ефективного запліднення та отримання біологічно повноцінних ембріонів.
Є різні думки фахівців про час і кратність запліднення корів з гормонально викликаним статевим полюванням. Як правило, таких корів запліднюють двічі: перший раз на початку появи статевого полювання та другий – через 12-24 години.
У нашій країні корів-донорів запліднюють штучно двічі на день з інтервалом 10-12 год. щоразу двома-трьома дозами замороженої сперми.
Для штучного запліднення корів-донорів застосовують три способи: візуальний(З використанням вагінального дзеркала); маноцервікальний(введення у піхву руки в рукавичці та укороченої піпетки); ректоцервікальний(з фіксуванням шийки матки та контролем просування запліднення за допомогою руки, введеної в пряму кишку).
Найвищу ефективність штучного запліднення корів-донорів забезпечує ректоцервікальний спосіб, що дозволяє контролювати стан статевих шляхів донора. День, коли проводиться штучне запліднення корови-донора, вважається датою запліднення.
Моноклональні антитіла – це імуноглобуліни, які синтезуються одним клоном клітин.
Перспективна гібридизація ракових та нормальних клітин на основі якої отримують гібриди – гібридоми, які продукують моноклональні антитіла.
Під гібридомою розуміють гібридну клітину, отриману на основі злиття продукуючої антитіла клітини з раковою клітиною, що надає гібридомі здатність необмеженого розмноження при культивуванні in vitro.
У цьому випадку гібридоми успадковують від нормальної батьківської клітини здатність виробляти цінну біологічну речовину антитіло, а від ракової клітини – здатність до необмеженого зростання та утворення моноклону.
Під антитілом розуміють білок, який синтезується імунною (захисною) системою організму, що зв'язується специфічно з антигеном.
В результаті захисної реакції на антиген (чуродний білок) утворюється ціла комбінація різних антитіл, що представляють неподільну суміш.
Тому ізолювати у чистому вигляді потрібне антитіло неможливо традиційним методом.
Отримати чисті антитіла певної лінії можна в тому випадку, якщо ізолювати клітину, що продукує потрібне нам антитіло і з неї утворити клон.
Антиутворюючі клітини здатні рости в живильному середовищі. Отже, їх треба злити (тобто з'єднати) з мієломними (раковими клітинами) клітинами здатними до необмеженого поділу в живильному середовищі та продукування моноклональних антитіл.
Способи вилучення ембріонів та його оцінка.
Ефективність методу трансплантації багато в чому визначається способом вилучення ембріонів. Існують різні способи вилучення ембріонів. Найпростіший – забій донора. Його застосовували на перших етапах розвитку трансплантації для демонстрації як навчальну практику і для наукових цілей. Час між убоєм донора і вимиванням ембріонів має перевищувати 30-40 хв., тобто. ембріони повинні бути отримані на початок процесу клітинного перетравлення в статевих органах. В даний час через втрату генетично цінної корови-донора він не застосовується.
Вилучення ембріонів хірургічним способом застосовували у 70-ті роки. Ембріони вилучають між 7-8-ми дібами після першого штучного запліднення. При вимиванні можна отримати в середньому 5 ембріонів кожного донора. Розроблено три прийоми: вилучення ембріонів через розріз верхнього склепіння піхви; лапаротомія з білої лінії живота (під наркозом донора); лапаротомія у сфері голодної ямки із застосуванням місцевої анастезії. Хірургічний спосіб вилучення ембріонів більш трудомісткий; необхідні висока кваліфікація хірурга, операційний зал та стерильні умови. Тому він застосовується в окремих випадках, тільки в наукових цілях.
Катетерний (нехірургічний) спосіб вилучення ембріонів практично не викликає будь-яких ускладнень в організмі тварини. Катетерним способом можна успішно видобувати ембріони у тваринницькому приміщенні. Ефективність способу висока, багаторазова. За допомогою катетерного способу одержують у середньому 4,3 нормального ембріона від 86% корів-донорів. У середньому, з вимитих яйцеклітин, до 25% виявляються незаплідненими або дегенерованими. Вимивають ембріони на 7-8 добу після запліднення. Для вимивання використовують живильне середовище Дюльбекко. Тривалість маніпуляції 20-50 хв.
Для отримання ембріонів цим способом розроблені спеціальні катетери. Промивне середовище вводять у роги матки 5-8 разів і видаляють їх за допомогою шприца. Промивання рогів матки забезпечує витяг до 76% ембріонів від числа овуляцій. Основну частину ембріонів, більше 50%, вилучають у перших трьох-чотирьох змивах, що знаходяться на стадії морули або бластоцисти при 32-х або 64-х бластомірах.
Після вимивання ембріонів матку вводять розчин антибіотиків з метою антисептики.
Перед пересадкою ембріона реципієнту, необхідно оцінити його якість та визначити спосіб пересадки. Оцінюють ембріони різними методами: морфологічний, прижиттєве забарвлення, цитологічний та ін.
Вважається, що ступінь точності морфологічного методу можна довести до 90 % і більше. Ембріони з яйцеводи в матку надходять на 3-5 добу, проте в межах 10-15% можуть надходити і через 6-8 діб. Ембріони, що не досягли певної стадії розвитку у зазначений час, як правило, гинуть. У цьому якість ембріонів оцінюється на 7-8-е добу за рівнем їх розвитку до бластоцисти.
При морфологічній оцінці особливу увагузвертають на зовнішню форму зиготи, стан зони пелюциду, число бластомерів, рівномірність дроблення, вираженість ембріобласту і трофобласта, чіткість в контурі клітин, вакуолізацію цитоплазми - просвітлення її переферії, деструкцію цитоплазми (збивання в грудку), цілісність клітинної мембран.
На ранніх стадіях дроблення особливе значення надається конфігурації бластомерів. Нормальна конфігурація забезпечує тісний контакт із найбільшою кількістюклітин при мінімальному обсязі. Неправильне дроблення клітин ембріонів призводить до порушення просторового розташування бластомерів, що призводить до порушення у наступних стадіях розвитку. Ембріони корів оцінюються на 7-8 день після першого запліднення під мікроскопом при 100-160 - кратному збільшенні.
У Росії її прийнято 5-ти бальна школа оцінки якості ембріонів, враховує: цілісність прозорої оболонки, рівномірність дроблення, стан цитоплазми, прозорість перевителів нового простору, відповідність стадії розвитку. Найбільш придатні для пересадки ембріони, оцінені 4 - 5 балами, що знаходяться в стадії пізньої морули або бластоцисти.
Для покращення морфологічної оцінки додатково використовують флуоресцентне забарвлення, що дозволяє відрізнити живих ембріонів від загиблих.
Оцінка якості ембріонів методом їхнього забарвлення заснована на здатності барвників забарвлювати морфологічні структури живої та мертвої клітини. Прижиттєве забарвлення ембріонів роблять нетоксичними барвниками.
Ідеальний ембріон повинен бути компактним, сферичної форми, з однорідним забарвленням, з клітинами однакової величини, з гладкою, плоскою та рівномірно сформованою зоною пеллюциду, без включень у перевітеліновому просторі.
Важливим критерієм оцінки якості ембріонів є інтенсивність розвитку стадій. Ембріони з уповільненим розвитком не використовуються для пересадки, заморожування та ін.
Вибраковуванню підлягають дегенеровані незапліднені яйцеклітини, які можна виявити при вилученні ембріонів. Непридатні для трансплантації ембріони мають дефектну морулу або бластоцисту, ознаками яких є дефекти прозорої оболонки, розпад бластомерів, різна величинабластомерів, порушення міжклітинного зв'язку.
Короткочасне культивування кріоконсервації та зберігання ембріонів.
Короткочасне зберігання та культивування (розвиток) ембріонів дає можливість транспортувати їх до інших господарств. В даний час широкого поширення набув метод короткострокового зберігання ембріонів in vitro. Встановлено, що ембріони корови можуть продовжувати свій розвиток до певних стадій при температурі тіла тварини у спеціальних культивованих (поживних) середовищах та у певних атмосферних умовах.
Після отримання та оцінки на життєздатність, ембріони переносять у живильні середовища з температурою 37 0 С. Розроблено кілька поживних середовищ для короткочасного зберігання ембріонів in vitro (95 год). Найчастіше як живильні середовища для культивування ембріонів використовують: ТС-199; Хема F-10; Голка, сольові розчини Дюльбека, Брінстера з різними біологічними та синтетичними добавками. Для підтримки оптимальних умоврозвитку ембріонів використовують газове середовище, що містить 90% азоту, 5% кисню та 5% вуглекислого газу. Культивування ембріонів у пробірках або соломинах є простішим методом, що дозволяє транспортувати ембріони на далекі відстані.
Другий метод короткочасного зберігання ембріонів здійснюється за температури 8-12 0 С, тривалість 3-4 діб. Швидкість охолодження повільна, щоб уникнути температурного шоку. Для цього використовують синтетичні середовища з різними білковими добавками: бичачий сироватковий альбумін (БСА), сироватку крові кнурів кастратів (СКГ), та нормальну сироватку бичків кастратів (НСБК).
p align="justify"> Третій метод короткочасного зберігання ембріонів протікає in vivo, тобто. у статевих органах проміжного реципієнта (кроликів, мишей та ін.) для транспортування на дальню відстань.
Метод заснований на високій толерантності (терпимості) слизової статевих шляхів самки в період тічки та полювання до чужорідних білків. І тому, в 1982г. було сконструйовано спеціальну камеру зберігання ембріонів у реципієнтів у черевній порожнині. У такій камері ембріони зберігаються протягом 72 год.
Ефективність трансплантації ембріонів великої рогатої худоби багато в чому визначається умовами зберігання зигот. Найефективнішим і перспективним методом консервації ембріонів є їхнє глибоке заморожування (кріоконсервація) рідкому азотіпри температурі – 196 0 С. Цей метод значно розширює можливості трансплантації та є надійною біотехнологічною основою селекції тварин.
При зберіганні заморожених ембріонів (-196 0 С) є ряд переваг, які дозволяють проводити пересадку ембріонів у будь-який час, створювати «банк» ембріонів від високоцінних племінних тварин, нечисленних та зникаючих порід, транспортувати ембріони будь-якої пори року.
Для заморожування ембріонів використовують автоматичні заморожувачі УОП-12. Щоб уберегти ембріони від руйнування при заморожуванні та відтаванні, застосовують спеціальні кріозахисні речовини, що легко проникають у клітину, – кріопротектор гліцерин.
Перед заморожуванням ембріони поміщають у кріопротектор із зростаючою концентрацією речовин для врівноваження осмотичного тиску. Існує швидкий спосіб кріоконсервування: охолодження від +20 0 С до - 6 0 З швидкістю 1 0 С/хв. Наступне охолодження до -35 0 З швидкістю 0,3 0 С/хв. Далі перенесення ембріона в рідкий азот.
Розморожують ембріони при 25 або 37 ° С протягом 10-12 с. Потім їх відмивають від кріопротектора та оцінюють. Виживання ембріонів має бути не нижче 80%, тілесність 55-60%, у цьому випадку трансплантація зоотехнічна та економічно рентабельна.
Відбір, підготовка та пересадка ембріонів реципієнтам.
В середньому на одного донора відбирають 5-6 реципієнтів, з урахуванням можливого подальшого вибракування через непридатність їх до відтворення. Корови-реципієнти повинні бути не старші 7 років з відсутністю гінекологічних відхилень, хорошими племінними кондиціями та відтворювальними властивостями. Телиці-реципієнти повинні бути 16-18 місячного віку з живою масою 350-380 кг.
Результати пересадки ембріонів у корів бувають високими лише в тому випадку, якщо день овуляції у донорів та реципієнтів збігається за часом, тоді слизові оболонки статевих органів донорів та реципієнтів знаходяться в ідентичних фізіологічних станах.
Для цього проводять групову синхронізацію статевого полювання. Розбіжності в синхронізації не повинні перевищувати 12 год. Запізнення полювання у реципієнтів на 10-12 год достовірно знижує відсоток проживлюваності ембріонів, а випередження полювання на 12 год не впливає на ефективність приживлюваності трансплантантів.
При правильній синхронізації можна досягти 90% ретельності реципієнтів, тоді як розбіжність у прояві статевого полювання між донором і реципієнтом більш ніж на 24 год, знижує готельність до 50% і нижче.
Розроблено способи пересадки ембріонів реципієнтами – хірургічний та нехірургічний. При хірургічному способі пересадки ембріонів застосовують лапаратомію по білій лінії живота або в ділянці зітхання. Лапаратомія проводиться під загальним наркозом при спинному стані тварини. Довжина розрізу білої лінії живота становить 10 див.
До 70-х років для вилучення та пересадки ембріонів великої рогатої худоби використовували в основному хірургічний спосіб. Проте, він потребує великих витрат коштів. Тому останні 10-15 років пересадку ембріонів переважно здійснюють нехірургічним способом.
Основною перевагою нехірургічного способу пересадки ембріонів, крім простоти великої економічності є можливість багаторазового використання реципієнта. Розроблено кілька способів, але вони засновані на одному принципі – введенні ембріона в ріг матки через шийку, внаслідок чого цей спосіб названий цервікальним. Катетер, в якому знаходиться паєта з ембріоном, обережно вводять до шийки матки і під ректальним контролем проводять через цервікальний канал, глибоко в ріг матки ближче до його верхньої частини і виштовхують ембріон разом із середовищем у просвіт рога матки.
На 60-ту добу після пересадки ембріонів реципієнтів перевіряють на наявність стельності методом ректальної пальпації. Цей метод є класичним та дає велику точність.
Використання методів трансплантації ембріонів та збільшення багатоплідності корів обумовлює необхідність визначення походження телят. Для цього використовують групи тварин із їх антигенами. Однакові групи крові можливі лише в однояйцеві близнюків. Визначення та уточнення походження телят необхідні у зв'язку з тим, що можуть бути помилки під час племінного обліку, використання сперми різних бугаїв. Групи крові тварин визначають у спеціальних лабораторіях моноспецифічними сироватками.
Екстракорпоральне запліднення та розвиток ембріонів поза організмом.
В даний час велика увага приділяється вивченню механізму екстракорпорального запліднення ооцитів або запліднення in vitro (тобто поза тваринного організму), що дозволяє більш інтенсивно використовувати у відтворенні високоцінних у племінному відношенні корів, що дозволить різко збільшити генетичний прогрес у популяції.
В даний час розроблені методи, що дозволяють виділити з яєчників корів до 200 ооцитів, культивувати їх та запліднити in vitro. Однак вихід повноцінних ембріонів залишається вкрай низьким, тому продовжуються дослідження, спрямовані на розробку нових та вдосконалення колишніх методик.
Запліднення ооцитів in vitro досягнуто у 20 видів ссавців, зокрема. і в людини, 1981 р. отримано нормальне потомство. Процес запліднення гамет проходить екстракорпорально та в контрольованих умовах. Остаточною оцінкою справжнього запліднення ооцитів in vitro є пересадка зиготи реципієнту та народження живої тварини.
Культивування ооцитів in vitro.
Екстракорпоральне запліднення передує культивування ооцитів in vitro.
Під культивуванням ооцитів in vitro розуміють процес дозрівання незрілих ооцитів у штучних живильних середовищах, у яких незрілі ооцити проходять мейотичне дозрівання до метафази другого поділу, тобто. до стадії готовності до запліднення.
Для виділення ооцитів з фолікулів зазвичай використовують яєчники від убитих корів і рідше яєчники, витягнуті оперативним шляхом. Після вилучення, найкращі яєчники (діаметром 2-6 мм) відбирають, інші вибраковують. Найбільш прийнятний метод вилучення ооцитів із фолікулів шляхом розтину їх лезом. Під контролем стерео мікроскопів МБС-9 та МБС-10 відбирають ооцити з компактними кумулюсами.
Для оцінки ооцитів за життєздатністю розроблено кілька методів, найбільшого поширення у тому числі отримав морфологічний.
До основних морфологічних ознак, що характеризують біологічну повноцінність ооцитів, відносять структуру клітин кумклюсу та самого ооциту.
Ооцит розміром 2-6 мм оточений клітинами кумулюса. Компактний, багатошаровий кумулюс, що щільно прилягає до ооциту, служить критерієм стійкості до атретічних змін у фолікулі, з якого вилучено ооцит.
Ооцити, придатні для культивування повинні відповідати наступним вимогам: форма округла; ооплазма дрібнозерниста, гомогенна, рівномірно заповнює весь ооцит; прозора оболонка рівномірна по ширині, опалесціює, округлої форми; кумулюс компактний, багатошаровий, що щільно прилягає до ооциту, однорідний.
Життєздатність ооцитів визначають за допомогою флюоресцентних барвників. Нежиттєздатні клітини забарвлюються через 7-10 хв, тоді як життєздатні не забарвлюються. Ооцити, що відповідають необхідним вимогам, ставлять на культивування.
Розроблено кілька способів культивування ооцитів. Основні з них: культивування у закритих судинах; у чашках Петрі живильному середовищі вкритому шаром вазелінової олії. За будь-яких способів культивування необхідні: стерильність на всіх етапах роботи; газовий стер; температура 39 0 З максимальної вологості.
Для культивування ооцитів ссавців залежно від виду тварин використовують культурні середовища двох видів: прості та синтетичні.
У всіх середовищах із зазначеними добавками (ЛГ, ФСГ та ін.) 80% ооцитів досягають стадії метафази другого поділу дозрівання. Таким чином, під час дозрівання ооцитів in vitro повністю завершується перший мейотичний поділ, а другий поділ дозрівання більшості ооцитів закінчується стадією мейозу метафази II. Остаточне завершення мейозу відбувається після запліднення.
Зміни у білковому синтезі ооцитів пов'язані не з ядерним, а з цитоплазматичним дозріванням, що має вирішальне значення для нормального запліднення та раннього ембріонального розвитку аж до імплантації ембріона у стінку матки реципієнта.
Капацитація сперміїв.
Щоб спермії могли запліднити яйцеклітину, вони мають відбутися зміни, що характеризують капацитацію, тобто. їхня готовність до запліднення.
Під капацитацією (дозріванням) сперміїв розуміють комплекс фізіологічних та фізико-хімічних змін, внаслідок яких спермії набувають здатності проникати через блискучу оболонку, пенетрувати та запліднити яйцеклітину.
У природних умовах капацитація відбувається під час проходження сперміїв генітальним трактом самки, де вони окремо від насіннєвої плазми. Капацитація може здійснюватися in vitro, якщо спермії будуть перебувати у певних культурних та газових середовищах.
Для капацитації сперміїв великої рогатої худоби розроблено культуральні середовища: Кребса-Рінгера, Тіроде, Брінстера. Тривалість капацитації сперміїв у цих середовищах становить 8 годин.
Для екстракорпорального запліднення застосовують глибокозаморожену сперму, упаковану в пакети.
Особливу проблему є об'єктивна оцінка капацитації сперміїв. Для підтвердження капацитації використовують акросомну реакцію. Після прикріплення сперміїв до зони пеллюциду яйцеклітини відбувається акросомна реакція.
Акросома являє собою органеллу спермію, багату різними ферментами і розташовану під плазматичною мембраною, що оточує голівку спермію. При акросомної реакції звільняються ферменти, що зумовлюють запліднювальну здатність сперміїв. Ферменти руйнують зону пеллюциду, що дозволяє спермію просунутися до ооплазми ооциту. З безлічі прониклих крізь зону пеллюциду ооциту сперміїв лише один зливається з плазматичною мембраною яйцеклітини та запліднює її. Виникає зигота.
Екстракорпоральне запліднення in vitro дозрілих ооцитів зводиться до наступного. Ооцити корів, що досягли стадії дозрівання метафази II, запліднюють капацитованими сперміями. У ряду видів с.-г. тварин залежно від якості визрілих in vitro гамет запліднюваність становить 50-70%. Основною причиною зниження здатності до ембріонального розвитку in vitro запліднених яйцеклітин є недосконалість культуральних середовищ для ранніх ембріонів, унаслідок чого розвиток ембріонів блокується на стадії 8-16 бластомерів.
Одержання ембріонів із запліднених in vitro ооцитів.
Кінцева мета екстракорпорального запліднення дозрілих ооцитів in vitro – отримання ембріонів придатних для трансплантації. При культивуванні ранніх ембріонів великої рогатої худоби найчастіше ембріональний розвиток блокується на стадії 8-16 клітин, тобто. коли в природних умовах ембріони переходять із яйцеводи в матку. Лише поодинокі ембріони розвиваються до стадій пізньої морули та бластоцисти, придатних для трансплантації.
Інкубацію ембріонів проводять двома способами: в яйцеводі кролика, вівці або корови та культурних середовищах, таких як ТС-199; ХЕМ-Ф-10; МРМ, сольові розчини Дюльбекко, Брінгстера з різними біологічними та синтетичними добавками.
Перший контроль за розвитком зародка проводять через 24 години після запліднення. Сінгамія, тобто. вступ у тісний контакт пронуклеусів, внаслідок чого відбувається остаточне злиття чоловічої та жіночої гамет, спостерігається через 19 годин після екстракорпорального запліднення та утворення двоклітинного ембріона через 22 години.
У 1983 р. народилося перше теля з дозрілого in vitro фолікулярного ооциту після його екстракорпорального запліднення. Незважаючи на суттєві позитивні результати з екстракорпорального запліднення ооцитів та отримання ембріонів in vitro, багато проблем, таких як удосконалення культивування ооцитів in vitro, капацитації сперматозоїдів та ін. залишаються невирішеними.
Клонування тварин
Термін «клон» (втеча) був уперше використаний в 1903 р. Вебером (Німеччина) стосовно рослин, що розмножуються вегетативним шляхом і означав, що дочірні рослини клону генетично ідентичні материнському.
Клонування- Отримання нащадків, які є точною генетичною копією організму. Сукупність таких нащадків - копій, що походять від одного організму, називають клоном. Організми в межах кожного клону характеризуються однаковою фенотиповою однорідністю та ідентичним генотипом.
Методи одержання генокопій:
1. Пересадка ядер соматичних клітин в енуклейовану яйцеклітину;
2. Індукування партеногенезу (андрогенез, гіногенез), що дозволяє повністю передавати нащадкам генотип або матері імені батька.
Диференційована соматична клітина містить повний набір генів, властивих даному організму. Каріотип таких клітин не відрізняється нічим від каріотипу заплідненої яйцеклітини (зіготи).
У тварин у соматичних клітинах після їхньої диференціації (7-8 день) відбувається стабільна репресія або інактивація частини геному, що обмежує використання ядер диференційованих клітин у клонуванні.
Етапи клонування:
Вилучення ядер (бластомерів у 8-16 клітинного ембріона);
Поділ яйцеклітини-реципієнта на ядровмісний та без'ядерний фрагменти (отримання енуклейованої яйцеклітини);
Злиття енуклейованої яйцеклітини з ядром (бластомерами) за допомогою інактивованого вірусу Сендай або електричного поля;
Приміщення реконструйованої зиготи огаровий циліндр;
Культивування ембріонів у яйцеводах проміжних реципієнтів до стадії бластоцисти (7-8 днів);
Пересадка бластацисти кінцевому реципієнту.
Chimaira– вогнедишна тварина, чудовисько з головою лева, тулубом кози та хвостом дракона.
Хімера- Збірна, складова тварина, що складається з генетично різнорідних клітинних популяцій, що відбуваються більш ніж від однієї заплідненої яйцеклітини.
З генетичного погляду химери- це продукт об'єднання 2 і більш ранніх ембріонів, внаслідок чого вони мають складний комбінований генотип.
Хімери- гібридні тварини, у нащадків відбувається розщеплення, але відсутня перекомбінація генів вихідних порід або видів, тому химери зберігають ознаки та властивості вихідних форм лише в 1 поколінні.
Методи отримання химер
Агрегаційний метод створення химер
Розроблено В. Тарковським (1961) та Б. Мінцем (1962) при отриманні химерних мишей.
З яйцеводів самок вилучають ембріони на 4-5 день після запліднення (8-16 бластомерів), обробляють ферментом проназою з метою звільнення від прозорої оболонки і зближують їх за допомогою скляної мікроголки або поштовхів струн з мікропіпетки мікроскопа (t0+370С). Об'єднані ембріони культивують протягом 24-48 годин до завершення агрегації.
Ін'єкційний метод створення химер
Розроблено Р. Гарднером (1968).
При цьому використовують ембріони на стадії бластоцисти (7-8 днів). Ембріон утримують всмоктувальною піпеткою, закріпленою на маніпуляторі, шляхом проколювання прозорої оболонки роблять отвір 2 скляними голками і розтягують його. У утворену щілину вводять третю голку і з її допомогою щілина перетворюється на отвір – форми, в який ін'єкційною піпеткою впорскуються внутрішня клітинна маса ембріона – донора.
Одержання трансгенних тварин.
Сучасні методи селекції с.-г. тварин базуються на використанні внутрішньовидової генетичної мінливості. Зазвичай види генетично ізольовані друг від друга, тобто. не схрещуються між собою, т.к. цьому перешкоджають так звані механізми репродуктивної ізоляції:
а) презиготичні - перешкоджають утворенню зигот;
б) постзиготичні – зниження життєздатності та плодючості тварин.
Подолати біологічні межі видів та використовувати міжвидову генетичну мінливість для створення нових форм тварин можна за допомогою перенесення генів.
Під перенесенням чужорідних генів розуміють пересадку поза організмом рекомбінантних молекул ДНК у клітині іншої тварини, незалежно від видової приналежності.
Якщо чужорідний ген інтегрувався в геном інших тварин, то такий ген позначається як трансген, а тварини називаються трансгенними. Білок, що кодується трансгеном, носить назву трансгенного продукту. Якщо тварини передають трансгени своїм нащадкам, утворюються трансгенні лінії.
Якщо відбулася інтеграція чужорідного гена у клітинах вищих тварин, то вони стають носіями нових спадкових властивостейта продукують нові для них речовини.
Для перенесення генів ссавцям використовують 3 методи:
Мікроін'єкцію рекомбінантної ДНК у пронуклеус зиготи;
Використання ретровірусів як вектори;
Ін'єкцію трансформованих ембріональних стовбурових клітин на ембріон.
1.21. Клітинна та генна інженерія. Біотехнологія
Клітинна інженерія - це напрям у науці та селекційній практиці, що вивчає методи гібридизації соматичних клітин, що належать різним видам, можливості клонування тканин або цілих організмів з окремих клітин.
Одним з найпоширеніших методів селекції рослин є метод гаплоїдів – отримання повноцінних гаплоїдних рослин із сперміїв або яйцеклітин.
Отримані гібридні клітини, що поєднують властивості лімфоцитів крові і пухлинних клітин, що активно розмножуються. Це дозволяє швидко та в потрібних кількостях отримувати антитіла.
Культура тканин- застосовується для отримання в лабораторних умовах рослинних або тваринних тканин, а іноді й цілих організмів. У рослинництві використовують для прискореного одержання чистих диплоїдних ліній після обробки вихідних форм колхіцином.
Вегетативне розмноження - застосовують для збереження сортів декоративних та культурних, овочевих та плодових рослин.
Генна інженерія- Штучне, цілеспрямоване зміна генотипу мікроорганізмів з метою отримання культур із заздалегідь заданими властивостями.
Основний метод генної інженерії - виділення необхідних генів, їх клонування та введення в нове генетичне середовище. Метод включає такі етапи роботи:
- виділення гена;
- його поєднання з молекулою ДНК клітини, яка зможе відтворювати донорський ген в іншій клітині (включення в плазміду) – кільцеву ДНК;
- введення плазміди в геном бактеріальної клітини – реципієнта;
- відбір необхідних бактеріальних клітин для практичного використання;
- дослідження у галузі генної інженерії поширюються як на мікроорганізми, а й у людини. Вони особливо актуальні при лікуванні хвороб, пов'язаних із порушеннями в імунній системі, у системі згортання крові, в онкології.
Біотехнологія- процес використання живих організмів та біологічних процесів у виробництві ліків, добрив, засобів біологічного захисту рослин; для біологічного очищення стічних вод, для біологічного видобутку цінних металів із морської води тощо.
Включення геном кишкової палички гена, відповідального за освіту в людини інсуліну, дозволило налагодити промислове отримання цього гормону.
Перспективи генної інженерії та біотехнології:
- створення організмів, корисних для людини;
- отримання нових лікарських засобів;
- корекція та виправлення генетичних патологій.
Еволюція
Органічна еволюція - це історичний процес пристосувальних перетворень живої природи усім рівнях організації живого, характеризується незворотністю і загальної прогресивної спрямованістю. В основі еволюційного процесу лежить відбір випадкових спадкових змін генетичної інформації, що забезпечують організмам переважні можливості для виживання та розмноження у певних умовах середовища. Ці зміни, що проявилися фенотипно, підхоплюються природним відбором, зберігаються та посилюються у процесі філогенезу. Зміни, що знижують життєздатність організмів та видів, відсіваються.
Творцем першої еволюційної теорії був Жан Батист Ламарк, який відстоював ідею змінності видів та їх цілеспрямованого розвитку. простих формдо складних. Проте присвоєння організмам внутрішнього прагнення прогресу (мети), і навіть твердження про успадкування ознак, набутих протягом життя особини, виявилися підтвердженими наступними дослідженнями. Помилковою виявилася і думка про прямий, завжди адекватний, вплив зовнішнього середовища на організм та його доцільну реакцію цього впливу. Заслуга розвитку еволюційних уявлень та створення цілісної теорії еволюції належить Ч. Дарвіну та А. Уоллесу, які обґрунтували принцип природного відбору, що виявили механізми та причини еволюції.
Генна інженерія.Розвиток молекулярної біології наприкінці ХХ ст. призвело до низки відкриттів, що мають важливе практичне значення. До таких досягнень належить створення методів синтезу та виділення генів, що започаткували генну інженерію.
Ми вже знаємо, що гени є ділянки ДНК, які кодують ферменти, білкові гормони, захисні, транспортні та інші білки. Багато хто з цих білків, синтезованих у клітинах бактерій, тварин чи рослин, представляють велику практичну цінність для медицини, сільського господарства, промисловості. Однак найчастіше вони виробляються клітинами в малих кількостях, і тому широке використання їх утруднене чи неможливе. Так, важливе значення для медицини має виробництво гормону білкового росту. Він виробляється гіпофізом і контролює зростання людського тіла, його нестача призводить до карликовості. Введення цього гормону дітям, які страждають на карликовість, забезпечує їм нормальний розвиток.
Якби ми навчилися вводити в клітини рослин нові гени, що кодують повноцінні білки, такі рослини не відрізнялися б за харчової цінності від продуктів тваринного походження. Нестача тваринних продуктів (молоко, яєць, м'яса, риби), які містять усі необхідні амінокислоти, відчуває більше половини населення Землі.
У клітинах деяких бактерій є білки, які здатні з високою ефективністю перетворювати світлову енергію Сонця на електричну енергію. Якби ми могли виробляти такі білки у великих кількостях, то на їх основі можна створити промислові установки для отримання дешевої електроенергії. Ці та багато інших завдань дозволяє вирішувати генна інженерія.
Сьогодні відомо кілька способів одержання генів, які кодують необхідні білки. Так, розроблено методи хімічного синтезу молекул ДНК із заданою послідовністю нуклеотидів. Більше того, вже синтезовано таким способом ряд генів, що кодують білкові гормони та інтерферони – білки, що захищають людину та тварин від вірусів.
Нарешті, необхідні гени можна синтезувати, а виділяти готовими з безлічі генів. Розроблено спеціальну техніку виділення одиночних необхідних генів з усієї маси ДНК, де їх є кілька десятків тисяч.
Синтезований або виділений ген можна вбудувати в ДНК, що самокопіюється, бактеріофага і ввести в бактеріальну клітину. Такі бактерії починають синтезувати людський чи тваринний гормон, необхідний фермент чи інтерферон. Цим способом у бактерію можна запровадити програму синтезу будь-якого білка людини, тварини чи рослини.
Потрібний ген людини або іншого організму можна ввести до бактерії, не вирізаючи його із ДНК. На малюнку 28 показана одна із схем отримання гена шляхом зворотної транскрипції, вбудовування його в бактеріальну плазміду та напрацювання бактерією «чужого» білка. У першому етапі з клітин виділяють иРНК, лічену з обраного гена. Потім на ній, як на матриці, синтезують нитку комплементарної ДНК (кДНК). Це здійснюють за допомогою ферменту зворотної транскриптази, що потребує початку синтезу в штучній затравці - короткому фрагменті ДНК, комплементарному матриці. Виходить гібридна ДНК-РНК-молекула. Після видалення РНК з цієї молекули на одноланцюгової ДНК, що залишилася, здійснюють синтез другої нитки. Внаслідок цього виникає повноцінна молекула ДНК. Використовуючи спеціальні ферменти, її вбудовують у бактеріальну плазміду – кільцеву позахромосомну молекулу ДНК, яка виконує роль переносника необхідного гена. Такий рекомбінантної, тобто містить чужорідну інформацію, плазмідою «заражають» бактеріальну клітину. У ній плазміда реплікується, і перенесений ген іншого мікроорганізму, людини, тварини чи рослини починає працювати. У бактеріальній клітині накопичується необхідний білок, залишається лише виділити його із бактеріальної маси. Таких бактерій розмножують у промислових масштабах та отримують необхідний білок у великих кількостях. Всі ці технологічні прийоми ґрунтуються на успіхах у пізнанні фізико-хімічних основ життя. Вирішення практичних завдань за допомогою описаних методів молекулярної біології та генетики і становить сутність генної інженерії.
Puc. 28. Схема одержання гена необхідного білка
Клітинна інженерія. Біотехнологія.До генної інженерії примикає клітинна інженерія, що базується на успіхах клітинної біології. Вчені навчилися поєднувати клітини різних видів рослин, поєднуючи їх генетичні програми. Такі клітини набувають нових властивостей, стають виробниками цінних лікарських чи харчових речовин, вітамінів. З таких гібридних клітин можна вирощувати цілі рослини з новими властивостями, що поєднують ознаки рослин різних видів, які зазвичай не схрещуються між собою. У зародки клітин тварин навчилися вводити нові гени та отримувати тварин із новими успадкованими властивостями.
Не за горами виправлення спадкової програми, отриманої дитиною від батьків, у тому випадку, якщо вона містить «зіпсовані» гени. Стане можливим введення в зародок на ранніх етапах його розвитку нормальних генів і цим позбавлення людей страждань, викликаних генетичними хворобами.
Людство вступило у нову епоху конструювання генетичних програм, і цій основі створюються нові форми мікроорганізмів, рослин, тварин. У техніці починається широке використання фізико-хімічних принципів роботи живої клітини, її енергетичних пристроїв для вирішення практичних завдань та створення промислових технологій. Виникло перспективне напрям у біології - біотехнологія.
- Які завдання стоять перед клітинною та генною інженерією?
- Якою є послідовність етапів отримання рекомбінантної плазміди?
- Які перспективи генної та клітинної інженерії?