La selección tradicional de microorganismos (principalmente bacterias y hongos) se basa en la mutagénesis experimental y la selección de las cepas más productivas. Pero incluso aquí hay algunas peculiaridades. El genoma de las bacterias es haploide, cualquier mutación aparece ya en la primera generación. Aunque la probabilidad de ocurrencia natural de una mutación en microorganismos es la misma que en todos los demás organismos (1 mutación por 1 millón de individuos para cada gen), una tasa de reproducción muy alta hace posible encontrar una mutación útil para el gen de interés al investigador.
Como resultado de la mutagénesis y la selección artificiales, la productividad de las cepas del hongo penicillium aumentó más de 1000 veces. Los productos de la industria microbiológica se utilizan para hornear, elaborar cerveza, elaborar vino y preparar muchos productos lácteos. Con la ayuda de la industria microbiológica se obtienen antibióticos, aminoácidos, proteínas, hormonas, diversas enzimas, vitaminas y mucho más.
Los microorganismos se utilizan para el tratamiento biológico. Aguas residuales, mejorar la calidad del suelo. En la actualidad se han desarrollado métodos para la obtención de manganeso, cobre y cromo en el desarrollo de botaderos de antiguas minas con ayuda de bacterias, donde los métodos de minería convencionales no son rentables económicamente.
Biotecnología- el uso de organismos vivos y sus procesos biológicos en la producción de sustancias necesarias para el hombre. Los objetos de la biotecnología son bacterias, hongos, células de plantas y tejidos animales. Se cultivan en medios nutritivos en biorreactores especiales.
Los últimos métodos de reproducción. microorganismos, plantas y animales son ingeniería celular, cromosómica y genética.
Ingeniería genética
Ingeniería genética- un conjunto de técnicas que le permiten aislar el gen deseado del genoma de un organismo e introducirlo en el genoma de otro organismo. Las plantas y los animales en los que se introducen genes "extraños" en el genoma se denominan transgénico, bacterias y hongos transformado. El objeto tradicional de la ingeniería genética es Escherichia coli, una bacteria que vive en el intestino humano. Es con su ayuda que se obtiene la hormona del crecimiento: la somatotropina, la hormona insulina, que se obtuvo previamente del páncreas de vacas y cerdos, la proteína interferón, que ayuda a hacer frente a una infección viral.
El proceso de creación de bacterias transformadas incluye los siguientes pasos.
- Restricción- "cortar" los genes necesarios. Se lleva a cabo con la ayuda de "tijeras genéticas" especiales, enzimas - restrictasa.
- Crear un vector- una construcción genética especial, en la que el gen previsto se introducirá en el genoma de otra célula. La base para crear un vector son los plásmidos. El gen se cose al plásmido utilizando otro grupo de enzimas: las ligasas. El vector debe contener todo lo necesario para controlar el funcionamiento de este gen: un promotor, un terminador, un gen operador y un gen regulador, así como genes marcadores que otorgan a la célula receptora nuevas propiedades que permitan distinguir esta célula de las células originales.
- Transformación- introducción del vector en la bacteria.
- Poner en pantalla- selección de aquellas bacterias en las que los genes introducidos funcionan con éxito.
- Clonación bacterias transformadas.
1 - celda con el plásmido original; 2 - plásmido aislado; 3 - creación de vectores; 4 — plásmido recombinante (vector); 5 — célula con plásmido recombinante.
Los genes eucariotas, a diferencia de los procariotas, tienen una estructura de mosaico (exones, intrones). No hay procesamiento en las células bacterianas, y la traducción en el tiempo y el espacio no está separada de la transcripción. En este sentido, es más eficiente utilizar genes sintetizados artificialmente para el trasplante. La plantilla para tal síntesis es el ARNm. Con la ayuda de la enzima transcriptasa inversa, primero se sintetiza una cadena de ADN en este ARNm. Luego se completa una segunda hebra con la ayuda de la ADN polimerasa.
ingeniería cromosómica
ingeniería cromosómica- un conjunto de técnicas que permiten manipulaciones con cromosomas. Un grupo de métodos se basa en la introducción en el genotipo de un organismo vegetal de un par de cromosomas homólogos extraños que controlan el desarrollo de los rasgos deseados ( lineas complementadas), o sustitución de un par de cromosomas homólogos por otro ( líneas reemplazadas). En las líneas sustituidas y suplementadas así obtenidas, se recogen rasgos que acercan las plantas a la "variedad ideal".
método haploide basado en el cultivo de plantas haploides con posterior duplicación de cromosomas. Por ejemplo, las plantas haploides que contienen 10 cromosomas se cultivan a partir de granos de polen de maíz ( norte= 10), luego los cromosomas se duplican y se vuelven diploides ( norte= 20), plantas completamente homocigotas en solo 2-3 años en lugar de 6-8 años de consanguinidad.
Esto también puede incluir metodo para la obtencion de plantas poliploides(ver Lección 23 Fitomejoramiento).
ingeniería celular
ingeniería celular— construcción de un nuevo tipo de células a partir de su cultivo, hibridación y reconstrucción.
Las células de plantas y animales, colocadas en medios nutritivos que contienen todas las sustancias necesarias para la vida, pueden dividirse, formando Culturas celulares. Las células vegetales también tienen la propiedad totipotencia, Eso es cuando ciertas condiciones son capaces de formar una planta de pleno derecho. Por lo tanto, es posible propagar plantas en tubos de ensayo colocando las células en ciertos medios nutritivos. Esto es especialmente cierto para plantas raras o valiosas.
Con la ayuda de cultivos celulares, es posible obtener valiosas sustancias biológicamente activas (cultivo celular de ginseng). La obtención y estudio de células híbridas permite resolver muchos problemas de la biología teórica (mecanismos de diferenciación celular, reproducción celular, etc.). Las células obtenidas como resultado de la fusión de protoplastos de células somáticas pertenecientes a diferentes especies (papa y tomate, manzana y cereza, etc.) son la base para crear nuevas formas de plantas. En biotecnología se utilizan anticuerpos monoclonales hibridomas- un híbrido de linfocitos con células cancerosas. Los hibridomas producen anticuerpos, como los linfocitos, y tienen la capacidad de multiplicarse indefinidamente en cultivo, como las células cancerosas.
El método de trasplante de núcleos de células somáticas en óvulos permite obtener una copia genética del animal, es decir, lo hace posible. clonación animales En la actualidad se han obtenido ranas clonadas y se han obtenido los primeros resultados de clonación de mamíferos.
El método de fusión de embriones en las primeras etapas permite crear quimérico animales De esta forma se obtuvieron ratones quiméricos (fusión de embriones de ratones blancos y negros), un animal quimérico ovino-cabrio.
Este manual contiene todo el material teórico de la asignatura de biología necesario para aprobar el examen. Incluye todos los elementos del contenido, verificados por materiales de control y medición, y ayuda a generalizar y sistematizar conocimientos y habilidades para el curso de la escuela secundaria (completa).
El material teórico se presenta de forma concisa y accesible. Cada sección va acompañada de ejemplos. elementos de prueba, permitiéndole probar sus conocimientos y el grado de preparación para el examen de certificación. Las tareas prácticas corresponden al formato USE. Al final del manual, se dan respuestas a las pruebas que ayudarán a los escolares y solicitantes a probarse a sí mismos y llenar los vacíos.
El manual está dirigido a escolares, aspirantes y docentes.
La ingeniería celular es una dirección en la ciencia y la práctica de mejoramiento que estudia los métodos de hibridación de células somáticas que pertenecen a diferentes especies, la posibilidad de clonar tejidos u organismos completos a partir de células individuales.
Uno de los métodos comunes de fitomejoramiento es el método haploide: obtener plantas haploides completas a partir de esperma u óvulos.
Se han obtenido células híbridas que combinan las propiedades de los linfocitos sanguíneos y tumorales, células en proliferación activa. Esto le permite rápidamente y en las cantidades adecuadas para obtener anticuerpos.
cultivo de tejidos - se utiliza para obtener en el laboratorio tejidos vegetales o animales y, a veces, organismos completos. En la producción de cultivos, se utiliza para acelerar la producción de líneas diploides puras después del tratamiento de las formas originales con colchicina.
Ingeniería genética- cambio artificial y intencionado en el genotipo de microorganismos para obtener cultivos con propiedades predeterminadas.
método principal- aislamiento de los genes necesarios, su clonación e introducción en un nuevo entorno genético. El método incluye los siguientes pasos de trabajo:
- aislamiento del gen, su combinación con la molécula de ADN de la célula, que puede reproducir el gen donante en otra célula (inclusión en el plásmido);
– introducción de un plásmido en el genoma de una célula bacteriana – un receptor;
– selección de las células bacterianas necesarias para el uso práctico;
– la investigación en el campo de la ingeniería genética se extiende no solo a los microorganismos, sino también a los humanos. Son especialmente relevantes en el tratamiento de enfermedades asociadas a trastornos en el sistema inmunitario, en el sistema de coagulación de la sangre, en oncología.
Clonación . Desde un punto de vista biológico, la clonación es la reproducción vegetativa de plantas y animales, cuya descendencia porta información hereditaria idéntica a la del progenitor. En la naturaleza se clonan plantas, hongos, protozoos, es decir organismos que se reproducen vegetativamente. En las últimas décadas, este término se ha utilizado cuando los núcleos de un organismo se trasplantan al óvulo de otro. Un ejemplo de tal clonación fue la famosa oveja Dolly, obtenida en Inglaterra en 1997.
Biotecnología- el proceso de uso de organismos vivos y procesos biológicos en la producción de medicamentos, fertilizantes, productos fitosanitarios biológicos; para el tratamiento biológico de aguas residuales, para la extracción biológica de metales valiosos del agua de mar, etc.
La inclusión en el genoma de Escherichia coli del gen responsable de la formación de insulina en humanos permitió establecer la producción industrial de esta hormona.
La agricultura ha logrado modificar genéticamente decenas de cultivos alimentarios y forrajeros. En la ganadería, el uso de la hormona del crecimiento producida biotecnológicamente ha aumentado la producción de leche;
usando un virus genéticamente modificado para crear una vacuna contra el herpes en cerdos. Con la ayuda de genes recién sintetizados introducidos en bacterias, se obtienen varias de las sustancias biológicamente activas más importantes, en particular hormonas e interferón. Su producción constituyó una importante rama de la biotecnología.
Con el desarrollo de la ingeniería genética y celular, cada vez hay más preocupación en la sociedad por la posible manipulación del material genético. Algunas preocupaciones están teóricamente justificadas. Por ejemplo, es imposible excluir el trasplante de genes que aumentan la resistencia a los antibióticos de algunas bacterias, la creación de nuevas formas de productos alimenticios, pero estos trabajos están controlados por los gobiernos y la sociedad. En cualquier caso, el peligro de enfermedad, desnutrición y otros shocks es mucho mayor que el de la investigación genética.
Perspectivas de la Ingeniería Genética y la Biotecnología:
- la creación de organismos útiles para los humanos;
– obtención de nuevos medicamentos;
– corrección y corrección de patologías genéticas.
EJEMPLOS DE TAREAS
Parte A
A1. La producción de drogas, hormonas y otras sustancias biológicas se lleva a cabo en una dirección tal que
1) ingeniería genética
2) producción biotecnológica
3) industria agrícola
4) agronomía
A2. ¿Cuándo sería el cultivo de tejidos el método más útil?
1) al recibir un híbrido de manzana y pera
2) cuando se cultiven líneas puras de guisantes de semilla suave
3) si es necesario, trasplantar la piel a una persona quemada
4) al recibir formas poliploides de repollo y rábano
A3. Para obtener artificialmente insulina humana por métodos de ingeniería genética a escala industrial, es necesario
1) introducir un gen responsable de la síntesis de insulina en bacterias que comenzarán a sintetizar insulina humana
2) inyectar insulina bacteriana en el cuerpo humano
3) sintetizar insulina artificialmente en un laboratorio bioquímico
4) hacer crecer un cultivo celular del páncreas humano responsable de la síntesis de insulina.
Parte CON
C1. ¿Por qué muchos en la sociedad tienen miedo de los productos transgénicos?
- 3.2. La reproducción de los organismos, su significado. Métodos de reproducción, semejanzas y diferencias entre reproducción sexual y asexual. El uso de la reproducción sexual y asexual en la práctica humana. El papel de la meiosis y la fertilización para asegurar la constancia del número de cromosomas en generaciones. Aplicación de la inseminación artificial en plantas y animales
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Conferencia #5
Tema: Biotecnología e ingeniería genética.
Preguntas: 1. El concepto de biotecnología
2. La ingeniería genética y sus métodos.
1. El concepto de biotecnología
La biotecnología moderna ocupa una posición de liderazgo en el sistema de investigación biológica, médica, veterinaria y zootécnica, es nueva forma tecnología industrial, que se basa en objetos biológicos: animales, plantas y microorganismos.
La meta y objetivos principales de la biotecnología están dirigidos a desarrollar métodos y técnicas que permitan obtener compuestos biológicamente activos (enzimas, hormonas, vacunas), así como construir moléculas de nuevas sustancias y crear nuevas formas de organismos que están ausentes en la naturaleza (moléculas quiméricas , animales).
En la cría de animales, se utilizan ampliamente varios métodos biotecnológicos (ingeniería genética y celular), con la ayuda de los cuales es posible acelerar el proceso de selección para crear nuevas razas de cultivos agrícolas altamente productivas. animales
En biotecnología, se utilizan dos términos que difieren en contenido semántico: "Ingeniería genética" - como método para estudiar e influir en los procesos que ocurren a nivel de moléculas y genes, y el término "Ingeniería genética" - como un conjunto de métodos llevados a cabo más ampliamente en las células y los organismos en general.
En principio, ambos términos son sinónimos e implican métodos que proporcionan alteración y reconstrucción del material genético, es decir. la formación de una nueva herencia.
El uso de los logros de la ingeniería genética se encuentra principalmente en las siguientes áreas:
estudio de la organización del aparato genético de los organismos superiores;
el uso de microorganismos como productores de sustancias económicamente útiles;
construir nuevos organismos mediante el trasplante de genes extraños, es decir, obtención de animales transgénicos.
aumentar la eficiencia y acelerar el proceso de selección;
aumento en la tasa de reproducción de las hembras;
preservación de poblaciones pequeñas y valiosas del acervo genético de razas en peligro de extinción;
obtener descendencia de animales estériles, pero genéticamente valiosos;
aumentar la resistencia de los animales a las enfermedades;
obtención de gemelos monocigóticos de un sexo específico;
obtener quimeras en desarrollo a partir de embriones de 5-6 días de edad de diferentes animales (razas, especies) y combinarlos en uno;
aumentar la fertilidad de las vacas al trasplantar la mitad del embrión en ambos cuernos uterinos.
Históricamente, la biotecnología surgió sobre la base de las industrias microbiológicas tradicionales (principalmente de fermentación). Muchas de estas "tecnologías" se utilizaron inconscientemente en la antigüedad en la producción de vino, cerveza, pan, leche agria y productos fermentados.
Con la ayuda de la biotecnología, actualmente se obtienen decenas de costosas sustancias biológicamente activas, entre ellas hormonas, enzimas, vitaminas, antibióticos, algunos medicamentos, como la insulina, el interferón y otros.
Para referencia: la insulina es una proteína que regula el azúcar en la sangre; el interferón es una proteína que protege a las células aún no afectadas de los virus (gripe).
Sin embargo, antes del advenimiento de la ingeniería genética, el interferón solo podía obtenerse en pequeñas cantidades de los leucocitos (glóbulos blancos).
Para obtener 1 gramo de interferón, debe procesar la sangre de 90 mil donantes.
Los desarrollos biotecnológicos se utilizan intensamente en la creación de procesos de producción sin residuos en el procesamiento de materias primas, purificación de agua a partir de aceite, aguas residuales, en el control de plagas de cultivos agrícolas. cultivos, obtención de forrajes y proteínas alimenticias, biogás, etc.
Entonces, con la ayuda de microbios, se obtiene aproximadamente 1 tonelada de levadura que contiene 600 kg de proteína a partir de 1 tonelada de aceite.
Y una cosa más: con la reproducción, 1 bacteria (en condiciones óptimas para la alimentación, el medio ambiente y otros factores) después de 44 horas podría formar tal descendencia, cuya masa correspondía a la masa de nuestro planeta (alrededor de 6.000.000.000.000.000.000.000 toneladas) .
Los métodos biotecnológicos, hace 6000 años, fueron utilizados por los pueblos de Mesopotamia a la hora de elaborar una bebida embriagadora, es decir, cerveza de aquellos tiempos.
Los antiguos egipcios sabían cómo elaborar cerveza utilizando levadura, azúcar y fermentación. Los romanos y los griegos usaban jugo de uva para hacer vino.
Con base en lo anterior, a la pregunta de qué es la biotecnología, podemos responder que es la ciencia de utilizar organismos vivos y procesos biológicos en la producción.
En relación con lo anterior, la historia del surgimiento y desarrollo de la biotecnología se puede dividir en tres etapas.
La primera etapa es el nacimiento de la biotecnología. Durante muchos cientos de años, las personas, sin conocimientos científicos de microbiología, bioquímica y otras ciencias, han desarrollado y utilizado con éxito en la práctica métodos biotecnológicos en la elaboración de pan, elaboración de queso, elaboración de vino, elaboración de productos lácteos fermentados, es decir, antiguas ramas de la actividad económica.
La segunda etapa (siglo XIX) es la formación de la biotecnología como ciencia. El comienzo del rápido desarrollo de las ciencias biotecnológicas: genética, microbiología, bioquímica, virología, fisiología, embriología, etc.
La tercera etapa (mediados de los años 70 del siglo XX) es el desarrollo de la biotecnología en varias direcciones utilizando los métodos de ingeniería genética y celular.
Los primeros métodos biotecnológicos en la ganadería fueron la inseminación artificial de animales y el ensilado de forrajes.
Por primera vez en Rusia en 1887 V.I. Shvedov trasplantado triturando huevos fertilizados - cigotos de rata.
La historia del trasplante de embriones bovinos comienza en 1950, cuando O. Willem (EE. UU.) trasplantó un óvulo fecundado de una vaquilla a otra y recibió un ternero vivo.
De los países europeos que comenzaron a utilizar el trasplante de embriones como método que acelera el proceso de selección y aumenta su eficiencia, cabe destacar Francia, Gran Bretaña, Dinamarca, Alemania, Italia, Bélgica y Eslovaquia.
La etapa actual en el desarrollo de la biotecnología está asociada con el descubrimiento de nuevos patrones en los procesos de vida de los organismos a nivel molecular.
El desarrollo de la biotecnología ha llevado a la creación producción industrial en la obtención de diversos preparados biológicos para su uso en medicina, medicina veterinaria, industria alimentaria.
Cada año, aumenta el número de tecnologías, métodos y preparaciones diseñadas para aumentar la productividad animal y la calidad del producto. Hay más de 450 empresas de biotecnología en todo el mundo que producen medicamentos para mantener la salud de los animales y aumentar su productividad.
Direcciones de la biotecnología.
Una de las áreas más prometedoras es la clonación de embriones, es decir, obtener el máximo número de crías de animales altamente productivos.
Para ello se ha desarrollado un método de creación de embriones idénticos (clones) introduciendo el núcleo de una célula de un embrión de un animal de clase alta en un óvulo no fecundado al que se le ha quitado previamente el núcleo, de escaso valor en términos de reproducción; división de embriones en dos, cuatro, seis y ocho partes.
Los embriones "sintéticos" de una sola célula han aprendido a crecer hasta la etapa de 8, 16 e incluso 32 células en el laboratorio. Por lo tanto, no solo se pueden implantar en vacas o congelar para su almacenamiento, sino que también se pueden utilizar para la clonación posterior. Así, se puede obtener in vitro un número ilimitado de embriones, excluyendo el procedimiento para tomarlos de animales altamente productivos. Teóricamente, de un embrión de ganado se pueden tener miles de animales.
Otro logro de la investigación biotecnológica en el campo de la cría de animales, que es de importancia práctica, es el método de obtención transgénico animales con un gen extraño "incrustado" en su genoma. Con su ayuda, se pueden obtener animales de rápido crecimiento con alta producción de leche, resistencia a enfermedades, etc. en un período corto.
Obtener incluso un animal con un trasplante de genes heredados se considera un gran logro. Tal animal se considera como la base para crear una nueva línea.
Hoy en día, la biotecnología se utiliza para resolver muchos problemas prácticos relacionados con la mejora de la eficiencia de la atención médica, el aumento de los recursos alimentarios del país y el suministro de materias primas a diversas industrias, la creación y el uso de fuentes de energía renovables rentables e industrias libres de desechos, la reducción de los impactos antropológicos nocivos en el medio ambiente y en otras industrias.
Actualmente, en los países más desarrollados, se han creado y se siguen creando empresas que, utilizando la biotecnología, producen piensos y aditivos para piensos, productos alimenticios, preparaciones medicas, realizar trasplantes de embriones y solucionar otros problemas económicos.
Se cree que el mayor progreso de la humanidad no solo dependerá en gran medida del desarrollo de la biotecnología, sino que simplemente no puede prescindir de ella, ya que no existen otras propuestas científicamente sólidas para proporcionar, en primer lugar, alimentos a la creciente población de la Tierra. .
Las áreas más prometedoras de la biotecnología son las producciones asociadas a la producción no tradicional en biofábricas, en las cantidades requeridas de proteína, aminoácidos esenciales, fármacos, biogás y conversión de energía solar.
2. Ingeniería genética y sus métodos
La ingeniería genética moderna utiliza un complejo de varios métodos y tecnologías a nivel de moléculas, elementos celulares (cromosomas, núcleos), células somáticas y germinales, en un organismo en diferentes etapas de ontogénesis.
El proceso de síntesis química del interferón a partir de la sangre de los animales es complejo y prolongado. Por ello, utilizamos microorganismos (E. Coli) obtenidos por ingeniería genética, capaces de producir interferones humanos, que activan procesos que afectan a la resistencia antiviral.
La insulina, la hormona del crecimiento humano y el interferón se obtuvieron mediante métodos de ingeniería genética en condiciones industriales. Se están desarrollando métodos para la síntesis de albúmina, varias vacunas, ciertas enzimas y la hormona del crecimiento. animales
Sobre la base de la ingeniería genética, se está creando la terapia génica, que permite corregir defectos hereditarios mediante la introducción de genes completos en el cuerpo. Se obtuvieron ratones gigantes de esta manera. El gen de la hormona del crecimiento ha sido "incrustado" en su genoma.
3. Ingeniería celular y embrionaria.
Ingeniería celular. La ingeniería celular se entiende como un método de construcción de un nuevo tipo de células a partir de su cultivo, hibridación y reconstrucción.
Una de las áreas importantes de la ingeniería celular es la hibridación de células somáticas.
Su esencia radica en la conexión de células con juegos de cromosomas de especies muy distantes.
La hibridación somática utiliza la capacidad de las células en un cultivo para combinarse en una sola y formar un núcleo que contiene cromosomas de diferentes genomas. Esto se hace usando el virus Sendai.
En la actualidad se han obtenido cultivos de células híbridas de decenas de especies lejanas (ratón x pollo; ratón x mono; conejo x mono; soja x guisante; soja x maíz, etc.).
Resultó posible combinar en una celda incluso formas tan distantes como pollo x levadura, etc.
Sin embargo, la incompatibilidad interespecífica sigue siendo la ley en la hibridación somática.
Con el tiempo, en un cultivo híbrido, se produce una división en células de ambos tipos, que no contienen cromosomas del segundo tipo.
Esta circunstancia resultó sumamente valiosa para estudiar la localización y naturaleza de la acción de ciertos genes.
ingeniería embrionaria. Esta área incluye la transferencia de embriones. La biotecnología en la reproducción y selección de ganado es de particular importancia. Los bovinos son mamíferos monocíticos. En el mejor de los casos, se produce un ternero por año de cada vaca, mientras que el ovario contiene cientos de miles de células germinales inmaduras, ovocitos, que representan una enorme reserva genética.
La solución cardinal al problema de la reproducción acelerada del ganado es cambiar a formas no tradicionales de aumentar la fertilidad. En el futuro, la biotecnología se plantea como la base para la reproducción acelerada de animales altamente productivos y de poblaciones enteras.
Los métodos de biotecnología utilizados en la práctica de la reproducción incluyen la inseminación artificial, la ultracongelación y almacenamiento a largo plazo del semen de toro, la inducción del celo y su sincronización, la regulación del tiempo de parto.
Recientemente, junto con estos métodos biotécnicos tradicionales, ha cobrado importancia práctica el trasplante de embriones, que se considera como un método biotecnológico eficaz para la reproducción acelerada de animales reproductores de gran valor.
El trasplante de embriones bovinos es un nuevo método biotécnico para la reproducción acelerada de animales altamente productivos, que aumenta significativamente el papel de los reproductores, es parte constituyente programas de reproducción y es una de las formas de intensificar el uso del potencial genético de las vacas que baten récords. El trasplante de embriones es efectivo solo cuando se utilizan animales genéticamente valiosos, se prueba la calidad de la descendencia y se reconoce que mejoran.
Si tenemos en cuenta que es posible recibir embriones de un donante 4-5 veces al año, entonces ya en etapa actual el desarrollo de la biotecnología del trasplante es evidente verdadera oportunidad recibo anual de 20-25 terneros de una vaca poseedora del récord. Utilizando 20 vacas récord como donantes de embriones, en 2-3 años es posible crear un hato lechero altamente productivo de 200-300 vacas. De la manera tradicional, no se pueden obtener más de 30 vaquillas y 30 toros de las mismas 20 vacas durante este período.
Las vacas, novillas, a las que se trasplantan los embriones, suelen denominarse receptoras, y las vacas de las que se obtienen los embriones se denominan donantes. El efecto del trasplante está determinado en gran medida por la elección de las vacas. Las mejores vacas o novillas se utilizan como donantes y las peores vacas o novillas se utilizan como receptoras.
Cuanto mayor sea la diferencia de calidad entre el donante y el receptor, más conveniente es el uso de un método de trasplante basado en el uso de vacas con una productividad récord como donantes. Para la inseminación de vacas donantes se utiliza el semen de los mejores toros, evaluado por la calidad de la descendencia.
Más importancia El método de trasplante de embriones se puede utilizar al criar y seleccionar toros de gran valor reproductivo, ya que aumenta la posibilidad de seleccionar toros de madres con una productividad récord.
La obtención de novillos para trasplante de progenitores sobresalientes no reduce el problema de la posterior evaluación de la calidad de la descendencia, pero aumenta significativamente la probabilidad de seleccionar (al aumentar el diferencial genético de las madres) mejoradores sobresalientes para su uso en plantas de mejoramiento y en cultivos a gran escala. condiciones de cría.
El uso del método de trasplante de embriones pone todo el trabajo de mejoramiento en un nuevo camino intensivo para el desarrollo de razas, proporcionando un aumento en la productividad a través de la producción y el uso generalizado de productores con alta capacidad combinatoria.
El trasplante de embriones se está desarrollando rápidamente y el método en sí se utiliza en el extranjero con fines comerciales. Se han establecido más de 80 centros comerciales de transferencia de embriones en los Estados Unidos. En este país, donde el trasplante de embriones tiene una sólida base tecnológica, se reciben anualmente más de 100 mil terneros. Se han establecido organizaciones comerciales similares para el trasplante de embriones en otros países desarrollados de Europa occidental. En la URSS, los avances en el trasplante de embriones comenzaron a mediados de la década de 1970.
El propósito del trasplante es:
Creación de razas, líneas, familias o tipos especializados de animales;
Consolidación o mejora de razas, líneas, familias de animales existentes;
Cruzamiento de razas, líneas, familias e hibridación interespecífica;
Regulación del embarazo múltiple de animales de granja;
Tenencia investigación científica y formación de especialistas (como proceso de aprendizaje).
Selección de donantes y poliovulación.
El criterio más importante en las primeras etapas de selección de vacas donantes es su alto valor genético, es decir, la capacidad de pasar genes de alta productividad a su descendencia. El valor de cría del donante debe ser confirmado no solo por la alta productividad de la vaca en sí, sino también por sus parientes. El grupo de donantes seleccionadas como madres de futuros toros incluye las mejores vacas de los rebaños de cría.
Primero, el valor de cría de una vaca donante está determinado por la productividad de la leche con una lactancia completa de 305 días, el contenido de grasa y proteína en la leche, la idoneidad de las vacas para el ordeño mecánico, la fuerza de la constitución y el exterior.
Al seleccionar, los donantes están sujetos a requisitos generales y especiales. A requerimientos generales Incluya lo siguiente:
El animal debe estar clínicamente sano;
El donante debe ser valorado por el tipo de sistema nervioso, conformación y constitución;
La donante debe ser evaluada en términos de cualidades reproductivas (desarrollo y estado fisiológico de los órganos genitales, duración del período de servicio, calidad y viabilidad de la descendencia);
Cada donante debe tener un certificado veterinario que indique su condición clínica.
Los requisitos especiales incluyen requisitos que contribuyen al logro del objetivo final de la transferencia de embriones, teniendo en cuenta lo siguiente:
El donante debe ser un representante típico de la raza, línea, familia en términos de exterior, constitución y características económicamente útiles;
El donante debe ser evaluado tribalmente utilizando métodos biométricos;
Los rasgos característicos económicamente útiles del donante deben evaluarse para determinar la posibilidad de su compatibilidad fenotípica en los genotipos animales previstos.
Los elevados costes de obtención de terneros por trasplante de embriones hacen necesaria la selección de tales donantes de las que se pueda obtener regularmente un gran número de embriones. Se debe dar preferencia a las vacas que hayan mantenido una capacidad reproductiva estable durante tres partos. De vacas donantes con buenas y estables capacidades reproductivas, se pueden obtener embriones regularmente cada 2 meses.
Si partimos de la posición generalmente aceptada de que se debe obtener un ternero por año de una vaca, entonces el período entre partos no debe exceder los 365 días en promedio. Por lo tanto, obtener un ternero de cada vaca en 365 días es el principal indicador de su buena capacidad reproductiva.
Para evaluar la capacidad reproductiva, puede utilizar el índice de capacidad reproductiva IVS, que está determinado por la fórmula IVS \u003d (n-1) 365 100 D, donde n es el número de terneros recibidos, D es el número de días entre el primer y el último parto. Con una capacidad reproductiva estable, el índice no debe exceder 100.
La duración del período embrionario en las vacas es en promedio de 285 días, por lo tanto, el período óptimo de servicio no debe exceder los 80 días. Durante este período, la vaca debe ser fertilizada.
Después de la selección de las vacas donantes, se inicia la ovulación múltiple (poliovulación). Este método fue desarrollado por el embriólogo soviético M.M. Zavadovsky y su personal. Demostraron que si se introducen hormonas gonadotrópicas en la sangre de una mujer, se estimula la maduración de un número adicional de folículos. Se utilizó suero de yegua preñada (FFK) como hormona gonadotrópica.
Un eslabón importante en la biotecnología moderna del trasplante de embriones bovinos es la inducción hormonal de superovulación en vacas donantes. Solo aquellas vacas que responden positivamente a la introducción de hormonas se transfieren al grupo de donantes.
Para estimular la ovulación múltiple, la gonadotropina FFA se usa en combinación con prostaglandinas y otras sustancias biológicamente activas. Este método le permite inducir la poliovulación en aproximadamente el 70% de las vacas. El resultado óptimo de la poliovulación es la liberación de 10 a 20 óvulos desde el ovario hacia el embudo del oviducto. El promedio de ovulaciones es de unas 10 y la fecundación de los óvulos alcanza el 80%.
Sin embargo, solo una pequeña proporción de donantes muestra una respuesta ovárica recurrente después de la inducción de la poliovulación. En general, las vacas donantes responden irregularmente al tratamiento hormonal repetido, es decir, una vez reaccionan bien y la otra vez reaccionan mal. Por lo tanto, el número de ovulaciones y la producción de embriones no son estables.
La poliovulación también está influenciada por factores como el estado de lactancia, mortinatos o partos difíciles, tiempo de estro, dosis de AGL, mes de parto, raza, condiciones económicas, peso corporal de la donante, estrés, nivel y calidad de la alimentación, etc.
Se reveló que el alargamiento del período de lactancia contribuye a una mejor reacción de las vacas a los AGL introducidos. El momento óptimo para inducir la poliovulación en vacas blancas y negras lactantes es a partir del día 60 después del parto.
Para optimizar la poliovulación y obtener embriones biológicamente valiosos, es necesario proporcionar una alimentación completa de la donante, equilibrada en todos los nutrientes.
La dosis óptima para vacas donantes FFA es de 2500-3000 UI. Cuando se inyecta a esta dosis, se obtiene un promedio de 9 ovulaciones por donante que responde positivamente.
El mayor efecto de poliovulación se logra con la introducción de AGL entre los 10-12 días del ciclo estral (fase lútea media) y después del 2º día de prostaglandina, que provoca la regresión del cuerpo lúteo, celo y ovulación. Dentro de las 48 horas de la inyección de prostaglandina, el 95% de las vacas donantes poliovulan con todos los signos de estro.
La poliovulación múltiple está sujeta a una gran variabilidad. Por lo tanto, no todas las vacas donantes tienen la misma predisposición a la ovulación múltiple. Para una poliovulación múltiple efectiva se requiere una cuidadosa selección de donantes para una serie de indicadores.
Selección de productores.
Al seleccionar toros, se evalúan por cariotipo para excluir anomalías cromosómicas. La descendencia de los toros seleccionados debe estar libre de defectos conformacionales.
En la gran mayoría de los casos, la selección de productores y donantes se realiza según el plan de apareamiento personalizado de acuerdo con el programa de cría. El esperma de los productores seleccionados para la inseminación de los donantes debe caracterizarse por la mayor fertilidad, no menos del 85-90%.
El criterio principal para la capacidad reproductiva de los productores es el indicador de la capacidad fertilizante de su esperma. Así, con el fin de evaluar la capacidad fertilizadora de los espermatozoides del semental que se está controlando (toro, verraco, carnero), se organiza un apareamiento de control. Para ello, se seleccionan tres o cuatro grupos de vacas (800-1000 cabezas) de diferentes rebaños.
Si la capacidad de fertilización del esperma del toro probado es del 60% o menos, entonces se descarta dicho toro. En la práctica, este indicador está determinado por el número (porcentaje) de vacas fecundadas desde la primera inseminación. La fertilidad está determinada por la ausencia de estro dentro de los 60-90 días posteriores a la inseminación.
Los métodos de inseminación artificial permiten determinar mucho antes la capacidad fertilizante de los espermatozoides. Así, la intensidad de sacrificio de toros en términos de actividad sexual y calidad del esperma es del 25-30%. Se rechaza una cantidad significativa de espermatozoides (20-30%) al evaluar eyaculados recién obtenidos, 10-15% - con control biológico de espermatozoides 24 horas después de la congelación.
Inseminación de vacas donantes.
La eficacia de la poliovulación se determina posteriormente por la eficacia de la inseminación artificial de las donantes. Los resultados de numerosos estudios muestran que solo el 60-65% de los embriones resultantes son aptos para ser trasplantados a receptores. El 35-40% restante son óvulos o embriones degenerados.
Para la inseminación artificial de vacas donantes, es necesario utilizar el semen de sementales sobresalientes, evaluados de manera confiable por la calidad de la descendencia.
Los requisitos para evaluar la fertilidad del semen de toro destinado a la inseminación de vacas donantes deben ser significativamente más altos que para la inseminación de otras vacas. La capacidad de fertilización de los espermatozoides de dichos toros debe ser de al menos el 70% con una alta precisión de su evaluación.
Para aumentar la fertilidad de las donantes y la liberación de embriones, junto con el uso de esperma de alta calidad, es necesario determinar el momento del estro para la inseminación artificial oportuna. Muchos signos de poliovulación indican que solo un período corto es más favorable para una fertilización efectiva y la obtención de embriones biológicamente valiosos.
Existen diferentes opiniones de expertos sobre el momento y la frecuencia de inseminación de vacas con estro inducido hormonalmente. Como regla, tales vacas son inseminadas dos veces: la primera vez al comienzo del estro y la segunda vez después de 12 a 24 horas.
En nuestro país, las vacas donantes son inseminadas artificialmente dos veces al día con un intervalo de 10-12 horas, cada vez con dos o tres dosis de semen congelado.
Se utilizan tres métodos para la inseminación artificial de vacas donantes: visual(usando un espéculo vaginal); manocervical(inserción en la vagina de una mano enguantada y una pipeta acortada); rectocervical(con fijación del cuello uterino y control del progreso de la pipeta de inseminación con una mano insertada en el recto).
La mayor eficiencia de la inseminación artificial de vacas donantes la proporciona el método rectocervical, que le permite controlar el estado del tracto genital de la donante. Se considera fecha de inseminación el día en que se realiza la inseminación artificial de la vaca donante.
Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas sintetizadas por un solo clon de células.
Prometedora es la hibridación de células cancerosas y normales, sobre la base de la cual se obtienen híbridos, hibridomas que producen anticuerpos monoclonales.
Por hibridoma se entiende una célula híbrida obtenida por fusión de una célula productora de anticuerpos con una célula cancerosa, que confiere al hibridoma la capacidad de reproducirse sin restricciones cuando se cultiva in vitro.
En este caso, los hibridomas heredan de una célula madre normal la capacidad de producir una sustancia biológica valiosa, un anticuerpo, y de una célula cancerosa, la capacidad de crecimiento ilimitado y la formación de un monoclon.
Un anticuerpo es una proteína sintetizada por el sistema inmunológico (protector) del cuerpo que se une específicamente a un antígeno.
Como resultado de una reacción protectora a un antígeno (proteína extraña), se forma una combinación completa de varios anticuerpos, que representan una mezcla indivisible.
Por lo tanto, es imposible aislar el anticuerpo deseado en forma pura por métodos tradicionales.
Es posible obtener anticuerpos puros de una determinada línea si aislamos la célula que produce el anticuerpo que necesitamos y formamos un clon a partir de ella.
Las células antiformadoras no pueden crecer en un medio nutritivo. Por lo tanto, deben fusionarse (es decir, conectarse) con células de mieloma (células cancerosas) capaces de dividirse ilimitadamente en un medio nutritivo y producir anticuerpos monoclonales.
Métodos de extracción de embriones y su evaluación.
La eficiencia del método de trasplante está determinada en gran medida por la forma en que se recuperan los embriones. Hay diferentes formas de recuperar embriones. La más sencilla es la matanza del donante. Se utilizó en las primeras etapas del desarrollo del trasplante para demostración como práctica educativa y con fines científicos. El tiempo entre el sacrificio de la donante y el lavado de los embriones no debe exceder los 30-40 minutos, es decir, los embriones deben obtenerse antes de que comience el proceso de digestión celular en los genitales. Actualmente, debido a la pérdida de una vaca donante genéticamente valiosa, no se utiliza.
La extracción quirúrgica de embriones se utilizó en los años 70. Los embriones se recuperan entre 7-8 días después de la primera inseminación artificial. Con el lavado, se puede obtener un promedio de 5 embriones de cada donante. Se han desarrollado tres métodos: extracción de embriones a través de una incisión en el fórnix superior de la vagina; laparotomía a lo largo de la línea blanca del abdomen (bajo anestesia del donante); laparotomía en la región de la fosa hambrienta con el uso de anestesia local. El método quirúrgico de extracción de embriones es más laborioso; Se requiere cirujano altamente calificado, quirófano y condiciones estériles. Por lo tanto, se usa en casos raros, solo con fines científicos.
El método de catéter (no quirúrgico) de extracción de embriones prácticamente no causa ninguna complicación en el cuerpo del animal. El método del catéter puede recuperar con éxito embriones en un edificio de ganado. La efectividad del método es alta, múltiple. Usando el método del catéter, se obtienen un promedio de 4,3 embriones normales del 86% de las vacas donantes. En promedio, de los huevos lavados, hasta el 25% no están fertilizados o están degenerados. Los embriones se lavan en el día 7-8 después de la inseminación. Para el lavado se utiliza el medio nutritivo de Dulbecco. La duración de la manipulación es de 20-50 minutos.
Para obtener embriones de esta forma, se han desarrollado catéteres especiales. El medio de lavado se inyecta en los cuernos del útero de 5 a 8 veces y se extrae con una jeringa. El lavado de los cuernos uterinos asegura la extracción de hasta el 76% de los embriones a partir del número de ovulaciones. La mayor parte de los embriones, más del 50%, se extrae en los tres o cuatro primeros lavados en estado de mórula o blastocisto con 32 o 64 blastómeros.
Después de lavar los embriones, se inyecta una solución antibiótica en el útero con el propósito de antisepsia.
Antes de transferir un embrión a una receptora, es necesario evaluar su calidad y determinar el método de transferencia. Los embriones se evalúan por varios métodos: morfológico, tinción intravital, citológico, etc.
Se cree que el grado de precisión del método morfológico se puede aumentar al 90% o más. Los embriones del oviducto ingresan al útero en el día 3-5, sin embargo, dentro del 10-15%, también pueden llegar después de 6-8 días. Los embriones que no han alcanzado una cierta etapa de desarrollo en un momento específico, por regla general, mueren. En este sentido, la calidad de los embriones se evalúa en el día 7-8 según el grado de desarrollo de los mismos hasta el blastocisto.
Con valoración morfológica Atención especial prestan atención a la forma externa del cigoto, el estado de la zona pelúcida, el número de blastómeros, la uniformidad del aplastamiento, la severidad del embrioblasto y trofoblasto, la claridad en el contorno de las células, la vacuolización del citoplasma - la aclaración de su periferia, la destrucción del citoplasma (aglomeración), la integridad de la membrana celular y la liberación del citoplasma al exterior.
En las primeras etapas de la escisión, la configuración de los blastómeros es de particular importancia. La configuración normal asegura un estrecho contacto con el numero mas grande células a un volumen mínimo. La fragmentación inadecuada de las células embrionarias conduce a la interrupción de la disposición espacial de los blastómeros, lo que conduce a la interrupción en las etapas posteriores de desarrollo. Los embriones de vaca se evalúan el día 7-8 después de la primera inseminación bajo un microscopio con un aumento de 100-160 veces.
En Rusia, se adoptó una escuela de 5 puntos para evaluar la calidad de los embriones, teniendo en cuenta: la integridad de la membrana transparente, la uniformidad del aplastamiento, el estado del citoplasma, la transparencia del espacio perivitelino y la correspondencia a la etapa de desarrollo. Los más aptos para el trasplante son los embriones de 4-5 puntos, que se encuentran en el estadio de mórula tardía o de blastocisto.
Para mejorar la evaluación morfológica, se utiliza adicionalmente la tinción fluorescente, que permite distinguir los embriones vivos de los muertos.
La evaluación de la calidad de los embriones por su método de tinción se basa en la capacidad de los colorantes para teñir las estructuras morfológicas de las células vivas y muertas. La coloración de por vida de los embriones se lleva a cabo con tintes no tóxicos.
El embrión ideal debe ser compacto, de forma esférica, de color uniforme, con células del mismo tamaño, con una zona pelúcida lisa, plana y uniformemente formada, sin inclusiones en el espacio peritoneal.
Un criterio importante para evaluar la calidad de los embriones es la intensidad de las etapas de desarrollo. Los embriones con retraso en el desarrollo no se utilizan para trasplante, congelación, etc.
Los huevos no fertilizados degenerados, que pueden detectarse durante la extracción de embriones, están sujetos a sacrificio. Los embriones no aptos para el trasplante tienen una mórula o blastocisto defectuoso, cuyos signos son defectos en la membrana transparente, el colapso de los blastómeros, valor diferente blastómeros, interrupción de la comunicación intercelular.
Cultivo a corto plazo, criopreservación y almacenamiento de embriones.
El almacenamiento a corto plazo y el cultivo (desarrollo) de embriones hace posible su transporte a otras granjas. Actualmente, el método de almacenamiento a corto plazo de embriones in vitro se ha generalizado. Se ha establecido que los embriones de vaca pueden continuar su desarrollo hasta ciertas etapas a la temperatura corporal del animal en medios de cultivo especiales (nutrientes) y bajo ciertas condiciones atmosféricas.
Después de la extracción y evaluación de viabilidad, los embriones se transfieren a medios nutritivos a una temperatura de 37 0 C. Se han desarrollado varios medios nutritivos para el almacenamiento a corto plazo de embriones in vitro (95 horas). Muy a menudo, los siguientes se utilizan como medios nutritivos para el cultivo de embriones: TS-199; Jamón F-10; Aguja, soluciones salinas de Dulbek, Brinster con diversos aditivos biológicos y sintéticos. por apoyar condiciones óptimas El desarrollo de embriones utiliza un ambiente gaseoso que contiene 90% de nitrógeno, 5% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. El cultivo de embriones en tubos de ensayo o pajuelas es un método más sencillo que permite el transporte de embriones a largas distancias.
El segundo método de almacenamiento a corto plazo de embriones se lleva a cabo a una temperatura de 8-12 0 C, la duración es de 3-4 días. La velocidad de enfriamiento es lenta para evitar el choque térmico. Para ello se utilizan medios sintéticos con diversos suplementos proteicos: albúmina de suero bovino (BSA), suero sanguíneo de verracos castrados (SCH), y suero normal de novillos castrados (NSBK).
El tercer método de almacenamiento a corto plazo de embriones tiene lugar in vivo, es decir, en los órganos genitales de un receptor intermedio (conejos, ratones, etc.) para su transporte a larga distancia.
El método se basa en la alta tolerancia (tolerancia) de la membrana mucosa del tracto genital femenino durante el estro y la caza de proteínas extrañas. Para ello, en 1982. Se construyó una cámara especial para almacenar embriones en los recipientes en la cavidad abdominal. En tal cámara, los embriones se almacenan durante 72 horas.
La eficiencia del trasplante de embriones bovinos está determinada en gran medida por las condiciones de almacenamiento de los cigotos. El método más eficaz y prometedor para conservar embriones es su ultracongelación (criopreservación) en nitrógeno líquido a una temperatura de -196 0 C. Este método amplía significativamente las posibilidades de trasplante y es una base biotecnológica confiable para la cría de animales.
Al almacenar embriones congelados (-196 0 C), hay una serie de ventajas que le permiten transferir embriones en cualquier momento, crear un "banco" de embriones de animales reproductores de alto valor, razas pequeñas y en peligro de extinción, y transportar embriones en cualquier momento. cualquier época del año.
Para la congelación de embriones, se utilizan congeladores de programa automático UOP-12. Para proteger los embriones de la destrucción durante la congelación y descongelación, se utilizan sustancias crioprotectoras especiales que penetran fácilmente en la célula: el glicerol crioprotector.
Antes de la congelación, los embriones se colocan en un crioprotector con una concentración creciente de sustancias para equilibrar la presión osmótica. Existe un método rápido de criopreservación: enfriamiento de +20 0 C a -6 0 C a razón de 1 0 C/min. Enfriamiento posterior hasta -35 0 C a una velocidad de 0,3 0 C/min. A continuación, transfiera el embrión a nitrógeno líquido.
Los embriones se descongelan a 25 o 37 0 C durante 10-12 s. Luego se lavan del crioprotector y se evalúan. La supervivencia del embrión debe ser al menos del 80%, el embarazo del 55-60%, en este caso, el trasplante es zootécnicamente y económicamente viable.
Selección, preparación y transferencia de embriones a receptoras.
De media, se seleccionan 5-6 receptoras por donante, teniendo en cuenta posibles descartes posteriores por su inadecuación para la reproducción. Las vacas receptoras no deben tener más de 7 años de edad, sin anomalías ginecológicas, buenas condiciones de crianza y cualidades reproductivas. Las novillas receptoras deben tener entre 16 y 18 meses de edad y un peso vivo de 350 a 380 kg.
Los resultados de la transferencia de embriones en vacas son altos solo si el día de la ovulación para donantes y receptoras coincide en el tiempo, entonces las membranas mucosas de los órganos genitales de donantes y receptoras se encuentran en idénticos estados fisiológicos.
Para ello se realiza una sincronización grupal de caza sexual. Las diferencias en la sincronización no deben exceder las 12 horas. Un retraso de 10 a 12 horas en el estro en las receptoras reduce significativamente la tasa de supervivencia de los embriones, y un avance del celo de 12 horas no afecta la eficiencia de la supervivencia del trasplante.
Con una sincronización adecuada, es posible lograr el 90% del embarazo de las receptoras, mientras que la discrepancia en la manifestación del estro entre la donante y la receptora por más de 24 horas reduce el embarazo al 50% o menos.
Se han desarrollado métodos para el trasplante de embriones por parte de los receptores, quirúrgicos y no quirúrgicos. En los métodos quirúrgicos de transferencia de embriones, se utiliza la laparotomía a lo largo de la línea blanca del abdomen o en la región ilíaca. La laparotomía se realiza bajo anestesia general con el animal en posición dorsal. La longitud de la incisión a lo largo de la línea blanca del abdomen es de 10 cm.
Hasta la década de 1970, la extracción y trasplante de embriones bovinos se realizaba principalmente de forma quirúrgica. Sin embargo, requiere mucho dinero. Por lo tanto, en los últimos 10-15 años, la transferencia de embriones se ha realizado principalmente de forma no quirúrgica.
La principal ventaja del método no quirúrgico de transferencia de embriones, además de la sencillez de gran economía, es la posibilidad de uso múltiple de la receptora. Se han desarrollado varios métodos, pero todos se basan en el mismo principio: la introducción del embrión en el cuerno uterino a través del cuello uterino, por lo que este método se denomina cervical. El catéter, en el que se encuentra la pajilla con el embrión, se inserta cuidadosamente en el cuello uterino y, bajo control rectal, se pasa a través del canal cervical, profundamente en el cuerno uterino más cerca de su parte superior, y el embrión es empujado junto con el medio en la luz del cuerno uterino.
En el día 60 después de la transferencia de embriones, se comprueba el embarazo de las receptoras mediante palpación rectal. Este método es clásico y da una gran precisión.
La introducción de métodos para trasplantar embriones y aumentar la multiplicidad de vacas requiere determinar el origen de los terneros. Para ello se utilizan grupos de animales con sus antígenos. Los tipos de sangre idénticos son posibles solo en gemelos idénticos. La determinación y aclaración del origen de los terneros es necesaria debido a que puede haber errores en la realización de los registros de cría, el uso de semen de diferentes toros. Los grupos sanguíneos de los animales se determinan en laboratorios especiales con sueros monoespecíficos.
Fecundación in vitro y desarrollo de embriones fuera del organismo.
En la actualidad, se presta mucha atención al estudio del mecanismo de la fecundación in vitro de los ovocitos, o fecundación in vitro (es decir, fuera del cuerpo del animal), que permite utilizar de forma más intensiva vacas de alto valor genético en la reproducción, lo que aumentará drásticamente progreso genético en la población.
Actualmente se han desarrollado métodos que permiten aislar hasta 200 ovocitos de ovarios de vaca, cultivarlos y fertilizarlos in vitro. Sin embargo, el rendimiento de embriones completos sigue siendo extremadamente bajo, por lo que la investigación continúa desarrollando nuevos métodos y mejorando los existentes.
La fertilización de ovocitos in vitro se ha logrado en 20 especies de mamíferos, incl. y en humanos, en 1981 se obtuvo descendencia normal. El proceso de fecundación de los gametos se realiza in vitro y en condiciones controladas. La evaluación final de una verdadera fecundación in vitro de ovocitos es el trasplante del cigoto a la receptora y el nacimiento de un animal vivo.
Cultivo de ovocitos in vitro.
La fecundación in vitro está precedida por el cultivo in vitro de ovocitos.
Por cultivo de ovocitos in vitro se entiende el proceso de maduración de ovocitos inmaduros en medios nutritivos artificiales, en el que los ovocitos inmaduros experimentan una maduración meiótica hasta la metafase de la segunda división, es decir, a la etapa de preparación para la fertilización.
Para el aislamiento de ovocitos a partir de folículos, por regla general, se utilizan ovarios de vacas sacrificadas y, con menos frecuencia, ovarios extraídos mediante cirugía. Después de la extracción, se seleccionan los mejores ovarios (2-6 mm de diámetro), el resto se descarta. El método más aceptable para extraer ovocitos de los folículos es cortándolos con una cuchilla. Bajo el control de los microscopios estereoscópicos MBS-9 y MBS-10 se seleccionaron ovocitos con cúmulos compactos.
Para evaluar los ovocitos por viabilidad, se han desarrollado varios métodos, el más utilizado de los cuales es el morfológico.
Las principales características morfológicas que caracterizan la utilidad biológica de los ovocitos incluyen la estructura de las células del cúmulo y el propio ovocito.
El ovocito de 2-6 mm está rodeado de células del cúmulo. Un cúmulo compacto de varias capas que está estrechamente adyacente al ovocito sirve como criterio para la resistencia a los cambios atrésicos en el folículo del que se extrajo el ovocito.
Los ovocitos aptos para el cultivo deben cumplir los siguientes requisitos: forma redonda; ooplasma de grano fino, homogéneo, llenando uniformemente todo el ovocito; concha transparente de ancho uniforme, opalescente, redondeada; cúmulo compacto, multicapa, muy adyacente al ovocito, homogéneo.
La viabilidad de los ovocitos se determina mediante colorantes fluorescentes. Las células no viables se tiñen después de 7-10 min, mientras que las células viables no se tiñen. Los ovocitos que cumplen los requisitos necesarios se colocan para el cultivo.
Se han desarrollado varios métodos para cultivar ovocitos. Los principales son: cultivo en recipientes cerrados; en cajas Petri en un medio nutritivo recubierto con una capa de aceite de vaselina. Con cualquier método de cultivo, se requiere lo siguiente: esterilidad en todas las etapas del trabajo; gas estéril; temperatura 39 0 C a máxima humedad.
Para el cultivo de ovocitos de mamíferos, dependiendo de la especie animal, se utilizan dos tipos de medios de cultivo: simples y sintéticos.
En todos los medios con los aditivos indicados (LH, FSH, etc.), el 80% de los ovocitos alcanzan la etapa de metafase de la segunda división de maduración. Así, durante la maduración de los ovocitos in vitro, la primera división meiótica se completa por completo, y la segunda división de maduración de la mayoría de los ovocitos termina con la etapa de meiosis en metafase II. La finalización final de la meiosis ocurre después de la fertilización.
Los cambios en la síntesis de proteínas de los ovocitos no están asociados con la maduración nuclear, sino con la citoplasmática, que es crucial para la fertilización normal y el desarrollo embrionario temprano hasta la implantación del embrión en la pared uterina de la receptora.
Capacitación espermática.
Para que los espermatozoides fertilicen un óvulo, deben ocurrir cambios en ellos que caractericen la capacitación, es decir. su disposición para la fecundación.
La capacitación espermática (maduración) se entiende como un conjunto de cambios fisiológicos y fisicoquímicos, como resultado de lo cual los espermatozoides adquieren la capacidad de penetrar la zona pelúcida, penetrar y fecundar el óvulo.
En condiciones naturales, la capacitación ocurre durante el paso de los espermatozoides por el tracto genital femenino, donde se separan del plasma seminal. La capacitación se puede llevar a cabo in vitro si los espermatozoides se encuentran en ciertos ambientes de cultivo y gas.
Para la capacitación de espermatozoides de bovinos se han desarrollado medios de cultivo: Krebs-Ringer, Tyrode, Brinster. La duración de la capacitación espermática en estos medios es de 8 horas.
Para la fecundación in vitro se utiliza esperma ultracongelado, envasado en bolsas.
Un problema particular es la evaluación objetiva de la capacitación de los espermatozoides. La reacción acrosomal se usa para probar la capacitación. Después de la unión de los espermatozoides a la zona pelúcida del óvulo, se produce una reacción acrosomal.
El acrosoma es un orgánulo espermático rico en varias enzimas y ubicado debajo de la membrana plasmática que rodea la cabeza del espermatozoide. Durante la reacción acrosomal, se liberan enzimas que determinan la capacidad de fertilización de los espermatozoides. Las enzimas destruyen la zona pelúcida, que permite que los espermatozoides avancen hacia el ooplasma del ovocito. De los muchos espermatozoides que han penetrado en la zona pelúcida del ovocito, sólo uno se fusiona con la membrana plasmática del óvulo y lo fecunda. Se desarrolla un cigoto.
La fertilización in vitro de ovocitos maduros in vitro es como sigue. Los ovocitos bovinos que han alcanzado la etapa de maduración de la metafase II se fertilizan con espermatozoides capacitados. En varios tipos de página - x. En animales, dependiendo de la calidad de los gametos madurados in vitro, la tasa de fertilidad es del 50-70%. La razón principal de la disminución de la capacidad de los óvulos fertilizados para el desarrollo embrionario in vitro es la imperfección de los medios de cultivo para los embriones tempranos, como resultado de lo cual el desarrollo de los embriones se bloquea en la etapa de 8 a 16 blastómeros.
Obtención de embriones a partir de ovocitos fecundados in vitro.
El objetivo final de la fecundación in vitro de ovocitos madurados in vitro es obtener embriones aptos para el trasplante. Cuando se cultivan embriones bovinos tempranos, en la mayoría de los casos, el desarrollo embrionario se bloquea en la etapa de 8 a 16 células, es decir, cuando en condiciones naturales los embriones pasan del oviducto al útero. Solo unos pocos embriones se desarrollan hasta las etapas tardías de mórula y blastocisto adecuadas para el trasplante.
Los embriones se incuban de dos formas: en el oviducto de conejo, oveja o vaca y en medios de cultivo como el TC-199; HEM-F-10; MRM, soluciones salinas de Dulbecco, Bringster con diversos aditivos biológicos y sintéticos.
El primer control sobre el desarrollo del embrión se realiza 24 horas después de la fecundación. singamia, es decir, la entrada en estrecho contacto de los pronúcleos, que da como resultado la fusión final de los gametos masculino y femenino, se observa 19 horas después de la fertilización in vitro y la formación de un embrión de dos células después de 22 horas.
En 1983 nació la primera cría de un ovocito folicular madurado in vitro tras su fecundación in vitro. A pesar de los resultados positivos significativos en la fecundación in vitro de ovocitos y la obtención de embriones in vitro, muchos problemas, como la mejora del cultivo de ovocitos in vitro, la capacitación de espermatozoides, etc., siguen sin resolverse.
clonación de animales
El término "clon" (retoño) fue utilizado por primera vez en 1903 por Weber (Alemania) en relación con las plantas que se propagan vegetativamente y significaba que las plantas hijas del clon son genéticamente idénticas a las progenitoras.
Clonación- obtener descendencia que sea una copia genética exacta del organismo. El conjunto de tales descendientes, copias que se originan de un organismo, se llama clon. Los organismos dentro de cada clon se caracterizan por la misma uniformidad fenotípica y el genotipo idéntico.
Métodos para la obtención de genocopias:
1. Trasplante de núcleos de células somáticas en un óvulo enucleado;
2. Inducción de la partenogénesis (androgénesis, ginogénesis), que permite que el genotipo o de madre a padre se transfiera completamente a la descendencia.
Una célula somática diferenciada contiene un conjunto completo de genes característicos de un organismo dado. El cariotipo de tales células no difiere en modo alguno del cariotipo de un óvulo fecundado (cigoto).
En animales en células somáticas después de su diferenciación (7-8 días), se produce una represión estable o inactivación de una parte del genoma, lo que limita el uso de núcleos celulares diferenciados en la clonación.
Pasos de clonación:
Extracción de núcleos (blastómeros en embriones de 8-16 células);
Separación del óvulo receptor en fragmentos nucleados y no nucleares (obteniendo un óvulo enucleado);
Fusión de un óvulo enucleado con un núcleo (blastómeros) utilizando un virus Sendai inactivado o un campo eléctrico;
La habitación del cigoto reconstruido es un cilindro de ogar;
Cultivo de embriones en los oviductos de receptoras intermedias hasta el estadio de blastocisto (7-8 días);
Trasplante de blastacisto al receptor final.
Chimaira- un animal que escupe fuego, un monstruo con cabeza de león, cuerpo de cabra y cola de dragón.
Quimera- un animal compuesto, compuesto, que consta de poblaciones de células genéticamente heterogéneas, que se originan a partir de más de un óvulo fertilizado.
Desde el punto de vista genético quimeras- es el producto de la unión de 2 o más embriones, por lo que tienen un genotipo combinado complejo.
quimeras- animales híbridos, la división ocurre en los descendientes, pero no hay recombinación de los genes de las razas o especies originales, por lo tanto, las quimeras conservan las características y propiedades de las formas originales solo en 1 generación.
Métodos de obtención de quimeras
Método de agregación para crear quimeras
Desarrollado por V. Tarkovsky (1961) y B. Mints (1962) al recibir ratones quiméricos.
Los embriones se extraen de los oviductos de las hembras a los 4-5 días después de la fecundación (8-16 blastómeros), se tratan con la enzima pronasa para liberarlos de la membrana transparente y unirlos con una microaguja de vidrio o empujando los hilos desde una micropipeta en un medio nutritivo bajo una capa de aceite de parafina en un microscopio de mesa calentado (t 0 +37 0 С). Los embriones agrupados se cultivan durante 24 a 48 horas hasta que se completa la agregación.
Método de inyección para crear quimeras
Desarrollado por R. Gardner (1968).
En este caso, se utilizan embriones en estado de blastocisto (7-8 días). El embrión se sujeta con una pipeta de succión unida al manipulador, perforando la cubierta transparente, se hace un agujero con 2 agujas de vidrio y se estira. Se inserta una tercera aguja en el espacio formado y, con su ayuda, el espacio se convierte en un orificio, un molde en el que se inyecta la masa celular interna del embrión donante con una pipeta de inyección.
Obtención de animales transgénicos.
Métodos modernos de selección de página - x. animales se basan en el uso de la variabilidad genética intraespecífica. Por regla general, las especies están genéticamente aisladas unas de otras, es decir, no se entrecrucen, porque Esto es impedido por los llamados mecanismos de aislamiento reproductivo:
a) precigótico: previene la formación de cigotos;
b) poscigóticos: una disminución en la viabilidad y fertilidad de los animales.
Para superar los límites biológicos de las especies y utilizar la variabilidad genética entre especies para crear nuevas formas de animales, es posible con la ayuda de la transferencia de genes.
Se entiende por transferencia de genes extraños el trasplante fuera del organismo de moléculas de ADN recombinante en la célula de otro animal, independientemente de la especie.
Si un gen extraño se ha integrado en el genoma de otro animal, dicho gen se denomina transgén y los animales se denominan transgénicos. La proteína codificada por el transgén se denomina producto transgénico. Si los animales transmiten transgenes a sus crías, se forman líneas transgénicas.
Si se ha producido la integración de un gen extraño en las células de animales superiores, entonces se convierten en portadores de nuevos propiedades hereditarias y producir nuevas sustancias para ellos.
Se utilizan tres métodos para transferir genes a los mamíferos:
Microinyección de ADN recombinante en el pronúcleo del cigoto;
Uso de retrovirus como vectores;
Inyección de células madre embrionarias transformadas en el embrión.
1.21. Ingeniería celular y genética. Biotecnología
ingeniería celular - esta es una dirección en la ciencia y la práctica de mejoramiento que estudia métodos de hibridación de células somáticas que pertenecen a diferentes especies, la posibilidad de clonar tejidos u organismos completos a partir de células individuales.
Uno de los métodos comunes de fitomejoramiento es el método haploide: obtener plantas haploides completas a partir de esperma u óvulos.
Se han obtenido células híbridas que combinan las propiedades de los linfocitos sanguíneos y tumorales, células en proliferación activa. Esto le permite rápidamente y en las cantidades adecuadas para obtener anticuerpos.
cultivo de tejidos- se utiliza para obtener en el laboratorio tejidos vegetales o animales y, a veces, organismos completos. En la producción de cultivos, se utiliza para acelerar la producción de líneas diploides puras después del tratamiento de las formas originales con colchicina.
Propagación vegetativa: se utiliza para preservar variedades de plantas ornamentales y cultivadas, hortalizas y frutas.
Ingeniería genética- cambio artificial y intencionado en el genotipo de microorganismos para obtener cultivos con propiedades predeterminadas.
El método principal de la ingeniería genética es la selección de los genes necesarios, su clonación e introducción en un nuevo entorno genético. El método incluye los siguientes pasos de trabajo:
- aislamiento de genes;
- su combinación con una molécula de ADN de una célula que puede reproducir el gen donante en otra célula (inclusión en un plásmido) - ADN circular;
- introducción del plásmido en el genoma de la célula bacteriana - el receptor;
- selección de células bacterianas necesarias para uso práctico;
- La investigación en el campo de la ingeniería genética se extiende no solo a los microorganismos, sino también a los humanos. Son especialmente relevantes en el tratamiento de enfermedades asociadas a trastornos en el sistema inmunitario, en el sistema de coagulación de la sangre, en oncología.
Biotecnología- el proceso de uso de organismos vivos y procesos biológicos en la producción de medicamentos, fertilizantes, productos fitosanitarios biológicos; para el tratamiento biológico de aguas residuales, para la extracción biológica de metales valiosos del agua de mar, etc.
La inclusión en el genoma de Escherichia coli del gen responsable de la formación de insulina en humanos permitió establecer la producción industrial de esta hormona.
Perspectivas de la Ingeniería Genética y la Biotecnología:
- la creación de organismos útiles para los humanos;
- obtención de nuevos medicamentos;
- corrección y corrección de patologías genéticas.
Evolución
evolución orgánica - este es un proceso histórico de transformaciones adaptativas de la naturaleza viva en todos los niveles de organización de los seres vivos, caracterizado por la irreversibilidad y una dirección progresiva general. El proceso evolutivo se basa en la selección de cambios hereditarios aleatorios en la información genética que proporcionan a los organismos oportunidades preferenciales de supervivencia y reproducción en determinadas condiciones ambientales. Estos cambios, que se manifiestan fenotípicamente, son recogidos por la selección natural, conservados y mejorados en el proceso de filogénesis. Se eliminan los cambios que reducen la viabilidad de organismos y especies.
El creador de la primera teoría evolutiva fue Jean-Baptiste Lamarck, quien defendía la idea de la variabilidad de las especies y su desarrollo intencionado a partir de formas simples a los complejos. Sin embargo, la asignación a los organismos de un deseo interno de progreso (objetivo), así como las declaraciones sobre la herencia de los rasgos adquiridos durante la vida de un individuo, no fueron confirmadas por estudios posteriores. La idea de una influencia directa, siempre adecuada, del ambiente externo sobre el organismo y su conveniente reacción a esta influencia resultó ser errónea. El crédito por el desarrollo de las ideas evolutivas y la creación de una teoría holística de la evolución pertenece a C. Darwin y A. Wallace, quienes fundamentaron el principio de la selección natural, revelaron los mecanismos y las causas de la evolución.
Ingeniería genética. El desarrollo de la biología molecular a finales del siglo XX. llevó a una serie de descubrimientos de gran importancia práctica. Entre tales logros se encuentra la creación de métodos para la síntesis y aislamiento de genes, que marcó el inicio de la ingeniería genética.
Ya sabemos que los genes son secciones de ADN que codifican enzimas, hormonas proteicas, protectoras, transportadoras y otras proteínas. Muchas de estas proteínas sintetizadas en células bacterianas, animales o vegetales son de gran valor práctico para la medicina, la agricultura y la industria. Sin embargo, la mayoría de las veces son producidos por células en pequeñas cantidades y, por lo tanto, su uso generalizado es difícil o imposible. Por lo tanto, la producción de hormona de crecimiento proteica es de gran importancia para la medicina. Es producido por la glándula pituitaria y controla el crecimiento del cuerpo humano, su deficiencia conduce al enanismo. La introducción de esta hormona en los niños que padecen enanismo asegura su desarrollo normal.
Si aprendiésemos a introducir nuevos genes que codifican proteínas completas en las células vegetales, estas plantas no tendrían un valor nutricional diferente al de los productos animales. Más de la mitad de la población mundial experimenta la falta de productos animales (leche, huevos, carne, pescado), que contienen todos los aminoácidos necesarios.
En las células de algunas bacterias existen proteínas que son capaces de convertir la energía lumínica del Sol en energía con una alta eficiencia. energía eléctrica. Si pudiéramos producir tales proteínas en grandes cantidades, entonces, sobre su base, sería posible crear plantas industriales para generar electricidad barata. Estos y muchos otros problemas pueden resolverse mediante ingeniería genética.
Hoy en día, se conocen varios métodos para obtener genes que codifican las proteínas necesarias. Así, se han desarrollado métodos para la síntesis química de moléculas de ADN con una determinada secuencia de nucleótidos. Además, de esta manera ya se han sintetizado una serie de genes que codifican hormonas proteicas e interferones, proteínas que protegen a humanos y animales de los virus.
Finalmente, los genes necesarios no pueden sintetizarse, sino aislarse listos para usar a partir de una variedad de genes. Se ha desarrollado una técnica especial para aislar genes individuales deseados de toda la masa de ADN, donde hay varias decenas de miles de ellos.
El gen sintetizado o aislado puede insertarse en el ADN del bacteriófago autocopiante e introducirse en la célula bacteriana. Tales bacterias comienzan a sintetizar una hormona humana o animal, la enzima deseada o el interferón. De esta forma, se puede introducir en la bacteria un programa para la síntesis de cualquier proteína humana, animal o vegetal.
El gen deseado de una persona u otro organismo se puede introducir en una bacteria sin eliminarlo del ADN. La Figura 28 muestra uno de los esquemas para obtener un gen por transcripción inversa, incrustarlo en un plásmido bacteriano y producir una proteína "extraña" por parte de la bacteria. En la primera etapa, el ARNm leído del gen seleccionado se aísla de las células. Luego, sobre ella, como sobre una matriz, se sintetiza una hebra de ADN complementaria a la misma (ADNc). Esto se lleva a cabo con la ayuda de la enzima transcriptasa inversa, que necesita una semilla artificial para iniciar la síntesis: un fragmento corto de ADN complementario a la plantilla. Resulta una molécula híbrida de ADN-ARN. Después de eliminar el ARN de esta molécula, la segunda cadena se sintetiza en el ADN monocatenario restante. El resultado es una molécula de ADN completa. Usando enzimas especiales, se inserta en un plásmido bacteriano, una molécula circular de ADN extracromosómico que actúa como portador del gen deseado. Dicho plásmido recombinante, es decir, que contiene información extraña, "infecta" una célula bacteriana. En él, el plásmido se replica y comienza a funcionar el gen transferido de otro microorganismo, humano, animal o vegetal. La proteína necesaria se acumula en la célula bacteriana, solo queda para aislarla de la masa bacteriana. Dichas bacterias se propagan a escala industrial y reciben la proteína necesaria en grandes cantidades. Todos estos métodos tecnológicos se basan en avances en la comprensión de los fundamentos físicos y químicos de la vida. La solución de problemas prácticos con la ayuda de los métodos descritos de biología molecular y genética es la esencia de la ingeniería genética.
Foto. 28. Esquema de obtención del gen de la proteína deseada
Ingeniería celular. Biotecnología. La ingeniería celular, basada en los éxitos de la biología celular, se une a la ingeniería genética. Los científicos han aprendido a conectar las células de diferentes especies de plantas, combinando sus programas genéticos. Tales células adquieren nuevas propiedades, se convierten en productores de valiosas sustancias medicinales o nutricionales, vitaminas. A partir de estas células híbridas, es posible cultivar plantas enteras con nuevas propiedades que combinan las características de plantas de diferentes especies que normalmente no se cruzan entre sí. Aprendieron cómo introducir nuevos genes en los embriones de células animales y obtener animales con nuevas propiedades hereditarias.
No muy lejos está la corrección del programa hereditario recibido por el niño de los padres, en el caso de que contenga genes "estropeados". Será posible introducir genes normales en el embrión en una etapa temprana de su desarrollo y así salvar a las personas del sufrimiento causado por las enfermedades genéticas.
La humanidad ha entrado en una nueva era de construcción de programas genéticos, y sobre esta base se están creando nuevas formas de microorganismos, plantas y animales. En tecnología, comienza el uso generalizado de los principios fisicoquímicos del trabajo de una célula viva, sus dispositivos de energía para resolver problemas prácticos y crear tecnologías industriales. Surgió una dirección prometedora en biología: la biotecnología.
- ¿Cuáles son los desafíos que enfrenta la ingeniería celular y genética?
- ¿Cuál es la secuencia de pasos para obtener un plásmido recombinante?
- ¿Cuáles son las perspectivas de la ingeniería genética y celular?